蛋氨酸亞砜還原酶A對線粒體氧化應(yīng)激損傷的保護作用及基因重組Tat-hMsrA中試工藝研究.pdf

1、第一部分 MsrA及其功能調(diào)節(jié)劑對線粒體氧化應(yīng)激損傷的保護作用及機制
　　目的:活性氧(ROS)的積累是細胞內(nèi)關(guān)鍵的致病因子之一。線粒體是其中最易受氧化應(yīng)激損傷的細胞器之一。蛋氨酸亞砜還原酶A(MsrA)介導的“蛋氨酸氧化-還原循環(huán)”是細胞中重要的抗氧化應(yīng)激機制,具有很強的細胞保護作用。本研究探討MsrA及其小分子功能調(diào)節(jié)劑L-蛋氨酸對過氧化氫(H2O2)誘導的線粒體氧化損傷的保護作用。
　　方法:質(zhì)粒構(gòu)建,細胞培養(yǎng),熒光成

2、像,氧化應(yīng)激造模,MTT染色,Western Blotting,電鏡觀察,線粒體膜電位檢測,線粒體超氧化物檢測。
　　結(jié)果:熒光成像實驗顯示MsrA與線粒體共定位。過表達MsrA或給予L-蛋氨酸(0.5-1mM)均可減輕H2O2誘導的線粒體膜電位變化和超微結(jié)構(gòu)變化,以及超氧化物的生成。局部預(yù)先給予L-蛋氨酸可減輕佛波酯(TPA)誘導的小鼠皮膚氧化性損傷。
　　結(jié)論:給予參與MsrA催化抗氧化循環(huán)的小分子化合物可能是預(yù)防氧化應(yīng)

3、激損傷的新策略.
　　第二部分 MsrA及其功能調(diào)節(jié)劑對線粒體呼吸鏈抑制劑MPP+所致神經(jīng)元凋亡的保護作用及機制
　　目的:MsrA作為一種參與線粒體保護的重要抗氧化酶,近年來被認為和衰老相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。MsrA對于Aβ、缺氧和6-OHDA引起的神經(jīng)細胞損傷都具有保護作用。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPP+)是一種線粒體呼吸鏈阻斷劑,也是最常用的建立帕金森病(PD)細胞模型的神經(jīng)毒素。本研究探討

4、基因重組蛋白Tat-rMsrA及其小分子功能調(diào)節(jié)劑L-蛋氨酸(L-Met)、硫甲基-L-半胱氨酸(SMLC)對MPP+引起的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用及機制。
　　方法:SH-SY5Y細胞培養(yǎng),Western Blotting,免疫組化,活性氧熒光染色,Tat-rMsrA的克隆和重組蛋白表達及純化,MTT染色,PI染色。
　　結(jié)果:衰老鼠中黑質(zhì)、紋狀體等PD相關(guān)腦區(qū)中MsrA的表達減少。基因重組蛋白Tat-rMsrA可

5、進入SH-SY5Y細胞,并減少MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷。L-Met和SMLC減少SH-SY5Y細胞中的活性氧熒光,并減輕過氧化氫和MPP+引起的SH-SY5Y細胞損傷。
　　結(jié)論: MsrA及其功能調(diào)節(jié)劑對MPP+引起的神經(jīng)細胞凋亡具有保護作用,其機制可能與其降低細胞內(nèi)活性氧水平有關(guān)。
　　第三部分基因重組 Tat-hMsrA的中試工藝路線研究
　　目的:MsrA是一種很好的抗氧化酶和蛋白修復(fù)酶,在體內(nèi)扮演

6、多種角色,與多種疾病和皮膚衰老密切相關(guān),如:白內(nèi)障、白癜風、光老化等等。MsrA可以像SOD一樣添加到化妝品、保健品和藥品當中,因此具有非常好的應(yīng)用前景。研究合成了人源性重組蛋白Tat-hMsrA。本實驗擬探討基因重組Tat-hMsrA的中試工藝路線,為將基因重組Tat-hMsrA的產(chǎn)業(yè)化打下良好的基礎(chǔ)。
　　方法:感受肽細胞的制備和轉(zhuǎn)化,基因的表達與檢測,包涵體蛋白純化及復(fù)性,親和層析純化,融合蛋白酶切,無his標簽蛋白純化,真

7、核質(zhì)粒的構(gòu)建。
　　結(jié)果:使用基因工程的方法構(gòu)建了原核pet32a-Tat-hMsrA質(zhì)粒,并從BL21(DE3),gammi,rosseta,gold篩選出最合適的宿主菌BL21(DE3),然后進行蛋白的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達,發(fā)現(xiàn)蛋白主要在包涵體表達。然后進行蛋白的變形和復(fù)性,從包涵體得到純化蛋白,檢測后無活性。融合蛋白在上清的表達量極低,放大工藝受阻，轉(zhuǎn)而開始構(gòu)建真核酵母表達質(zhì)粒ppic9k,電轉(zhuǎn)化