基于比色法檢測蛋氨酸亞砜還原酶活性新方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、文章從以下三部分就基于比色法檢測蛋氨酸亞砜還原酶活性新方法的建立及應(yīng)用進行了綜述。
　　第一部分 基因重組鼠源性蛋氨酸亞砜還原酶的構(gòu)建、表達和純化
　　目的:蛋氨酸亞砜還原酶A(methionine sulfoxide reductase A,MsrA)是蛋氨酸亞砜還原酶家族的一員,能夠特異性的還原結(jié)合型和游離型的S-型蛋氨酸亞砜,在生命體內(nèi)調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài),從而在對抗氧化應(yīng)激的細胞保護中發(fā)揮重要作用。本實驗室擬對含有穿膜肽

2、TAT的MsrA蛋白作為新型生物藥物進行開發(fā),因此利用原核載體構(gòu)建并表達TAT-rMsrA序列的重組蛋白。
　　方法:含有鼠源性 MsrA(rMsrA)表達序列的重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-rMsrA)由瑞士蘇黎世大學(xué)教授Dr.Bertrand Friguet(Universite′Paris7-Denis Diderot, France)友情贈送。通過 PCR技術(shù)獲得編碼 rMsrA的cDNA。5’端引物包含一個BamHI位點(

3、5'-AAAGGATCCATGCTCTCCGCCTCCAGAAGGAC-3’引物),3’端引物含有一個XhoI位點(5’-AAACTCGAGTTACTTTTTAATGGCCGTGGGACAGG-3’)。擴增后的產(chǎn)物和PET-32a(+)蛋白表達載體均用BamHI和XhoI消化,通過T4 DNA連接酶將表達完整的rMsrA編碼序列的PCR片段連接到PET-32a載體的啟動子下游,構(gòu)建得到Trx-His-TAT-MsrA-融合蛋白。插入的克

4、隆核苷酸序列通過至少兩次每個方向的測序得到確定。[1]提取質(zhì)粒后,轉(zhuǎn)染 BL21表達載體,使用平板培養(yǎng)篩選出轉(zhuǎn)染成功的菌落,擴增并誘導(dǎo)大量表達,提取重組蛋白,并采用Ni-層析柱純化得到融合蛋白。使用輕鏈腸激酶酶切處理后再次過柱純化,得到純化的基因重組TAT-MsrA酶。
　　結(jié)果:SDS-PAGE電泳染色和Western Blotting結(jié)果顯示,MsrA重組蛋白表達載體構(gòu)建成功,并且可以用于大量表達目的蛋白。此方法得到的MsrA

5、重組蛋白純度高達92％,抗原活性顯示陽性反應(yīng)。
　　結(jié)論:使用該基因工程方法可以成功制備高純度和活性的MsrA酶。
　　第二部分 比色法檢測蛋氨酸亞砜還原酶催化活性
　　目的:傳統(tǒng)檢測MsrA酶活性的方法主要依賴于液閃計數(shù)儀或HPLC-MS檢測系統(tǒng),但由于這些儀器普及型不強,樣本前處理復(fù)雜,檢測步驟費時,不適用于快速檢測和監(jiān)控基因工程重組蛋白的酶活性。為快速檢測和監(jiān)控MsrA酶活性,本研究基于MsrA在體外催化 DTT

6、還原蛋氨酸亞砜的反應(yīng)機制,建立一種通過化學(xué)顯色法快速檢測MsrA催化活性的新方法。通過DTT和DTNB的化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)物TNB在412 nm波長下檢測吸光度A值,使用酶標儀可以簡單快速的監(jiān)測DTT的消耗,從而間接反映MsrA的催化活性(吸光度大小與含量正相關(guān))。
　　方法:通過LC-MS方法,檢測實驗預(yù)設(shè)的標準反應(yīng)體系發(fā)生生物催化反應(yīng)的合理性。通過繪制DTT-DTNB的標準反應(yīng)曲線,確定DTT準確檢測的濃度范圍。最后通過酶濃度、時間

7、的量效反應(yīng)曲線確定酶反應(yīng)的飽和濃度和飽和時間,確定最佳反應(yīng)體系的條件。
　　結(jié)果:LC-MS的檢測結(jié)果顯示:在50μM DTT存在的條件下,MsrA能夠成功催化L-MetO還原成Met。DTT-DTNB標準曲線說明DTT在0-200μM范圍內(nèi),OD412nm(412 nm處吸光度)對DTT濃度作回歸曲線,方程為y=0.0138x-0.0073,r2=0.9999。酶的濃度和時間曲線確定了500μM L-MetO,50μM DTT,

8、pH8.0的條件下,MsrA的飽和濃度和飽和時間分別為0.1μg/μL和2 h。
　　結(jié)論:根據(jù)體外 MsrA催化的蛋氨酸亞砜與 DTT的生化反應(yīng),建立一種基于DTT-DTNB反應(yīng)的體外快速檢測MsrA活性的化學(xué)比色法。
　　第三部分 比色法檢測甲基亞砜類物質(zhì)含量
　　目的:甲基亞砜類物質(zhì)是MsrA的特異性底物,因其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,無特異光學(xué)吸收性質(zhì)等,難以快速簡易的檢測其在溶液中的濃度。本實驗旨在利用酶促反應(yīng)中,底物初始濃

9、度和酶促反應(yīng)的初速度成正比的特性,建立一種通過基于酶促反應(yīng)快速檢測甲基亞砜類化合物濃度的新方法,以代替操作復(fù)雜,儀器要求較高的液相色譜-質(zhì)譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法。
　　方法:一定時間內(nèi),酶促反應(yīng)的初速度保持不變,因此 DTT的消耗量和反應(yīng)時間成正比。在實驗室條件下,先測定酶促反應(yīng)初速度保持不變的時間點;然后在此時間點,檢測單位時間內(nèi) DTT的消耗量,反映酶促反應(yīng)的初速度。進一步建立不同底物(DMSO、MetO和舒林酸)的初始濃

10、度和酶促反應(yīng)初速度的線性相關(guān)曲線。
　　結(jié)果:從時間-反應(yīng)曲線可知,0-120 min時間范圍內(nèi),DTT的消耗量和反應(yīng)時間成正比例線性關(guān)系,說明酶促反應(yīng)的初速度保持不變。因此,我們選擇了60 min作為時間點,檢測不同底物濃度下 DTT的消耗量,測定初始濃度和酶促反應(yīng)初速度的線性回歸曲線。DMSO和L-MetO的效應(yīng)-濃度曲線方程分別為y=0.0002x+0.008,r2=0.986和y=0.0006x+0.0147,r2=0.9

11、846。舒林酸在修正非酶影響因子之后,0-100μM范圍內(nèi)反應(yīng)方程式為y=0.0094x+0.0925,r2=0.976。
　　結(jié)論:本實驗建立了一種基于MsrA生物酶促反應(yīng)的快速檢測甲基亞砜類化合物濃度的新方法,該方法經(jīng)過對多種底物的檢驗,證實在限定的濃度范圍內(nèi)(L-MetO0-640μM,DMSO0-800μM,舒林酸0-100μM)能夠快速的檢測處溶液中的甲基亞砜類物質(zhì)的含量。該方法可廣泛應(yīng)用于化工和醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)τ诩谆鶃嗧款愇?/p>