單環(huán)刺螠(Urechis unicinctus)硫醌氧化還原酶的研究.pdf

1、硫化物是一種廣泛分布的有毒物質(zhì)。單環(huán)刺螠隸屬于螠蟲動(dòng)物門(Echiuroidea)、螠綱(Echiudda)、無管螠目(Xenopneusta)、刺螠科(Urechidae)、刺螠屬(Urechis),是一種海洋底棲生物,主要棲息于近海岸潮間帶或潮下帶泥性底質(zhì)中。前期研究已經(jīng)證明該物種具有較強(qiáng)的硫化物耐受與解毒能力。而線粒體硫化物氧化是生物體硫化物解毒的一種重要方式。硫醌氧化還原酶是線粒體硫化物氧化酶促反應(yīng)鏈中的第一個(gè)酶。本研究克隆了單

2、環(huán)刺螠硫醌氧化還原酶全長cDNA,通過重組表達(dá)獲得具有活性的SQR,對(duì)其體外酶學(xué)特性和在體內(nèi)mRNA水平、蛋白質(zhì)水平以及硫化物誘導(dǎo)下的表達(dá)進(jìn)行了分析,以期揭示單環(huán)刺螠SQR的生物學(xué)特性,為深入探討硫化物代謝的分子機(jī)制以及開發(fā)單環(huán)刺螠成為沿海硫化物代謝研究的模式生物提供科學(xué)依據(jù)。
　　 采用同源克隆策略結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到硫醌氧化還原酶全長cDNA序列,結(jié)果顯示單環(huán)刺螠SQR(GenBank序列號(hào):EF487538)全長231

3、5 bp,其中開放閱讀框長1356 bp,可以編碼451個(gè)氨基酸。蛋白理論分子量為50.5 kDa,理論等電點(diǎn)為8.98。氨基酸序列中含有保守的FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域、半胱氨酸(Cys202和Cys380)、組氨酸(HisS0和His294)和谷氨酸(Glu159)。
　　 采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)單環(huán)刺螠各組織SQR mRNA表達(dá)的分析結(jié)果表明:中腸表達(dá)量最高,肛門囊和體腔液細(xì)胞次之,體壁、呼吸腸表達(dá)量最低。
　　 構(gòu)建原核

4、表達(dá)載體pET28a-SQR和pET32a-SQR,轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行重組表達(dá),結(jié)果顯示SQR均以包涵體形式表達(dá)。純化包涵體后,采用稀釋復(fù)性的方法獲得具有活性的單環(huán)刺嗌SQR。通過條件優(yōu)化確定最佳稀釋復(fù)性條件為pH 8.0,蛋白濃度20μg/ml,L-精氨酸濃度0.2 mol/L,還原型谷胱甘肽:氧化型谷胱甘肽=10:1,復(fù)性時(shí)間為96 h。隨后對(duì)復(fù)性蛋白的酶學(xué)特性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示復(fù)性SQR比活為5.12μM/min/mg(25℃,pH

5、 8.0),其最適作用溫度為37℃,最適pH為8.5。采用米氏方程雙倒數(shù)法測(cè)定兩種底物硫化物和泛醌的Km分別為40.3μM和15.6μM?；瘜W(xué)試劑EDTA和GSH對(duì)該酶具有激活作用,而Zn2+具有抑制作用。
　　 用純化的重組SQR免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體后,采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)SQR的體內(nèi)表達(dá)進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示在體內(nèi)該蛋白大約60kDa。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)單環(huán)刺螠各組織SQR的細(xì)胞表達(dá)定位進(jìn)行研究,結(jié)果顯示:SQR主

6、要在各結(jié)構(gòu)的上皮組織及近表面組織中表達(dá),如體壁中SQR主要定位于上皮細(xì)胞的游離面和皮下的疏松結(jié)締組織中;呼吸腸中主要定位于假復(fù)層纖毛柱狀上皮的游離面;中腸中同樣定位于上皮細(xì)胞的游離面;肛門囊中則定位于整個(gè)復(fù)層上皮中。然而,SQR在上述結(jié)構(gòu)深層的肌肉層和體腔膜或漿膜中均無表達(dá)。
　　 熒光定量PCR檢測(cè)顯示硫化物暴露后單環(huán)刺螠體壁和呼吸腸SQR mRNA表達(dá)均呈濃度和時(shí)間依賴的特征。體壁SQR mRNA在硫化物(25μM,50μM

7、和150μM)暴露12h時(shí)顯著性提高,并且隨著硫化物暴露時(shí)間的延長,表達(dá)量持續(xù)提高,至硫化物暴露48h時(shí)達(dá)到峰值。呼吸腸SQR mRNA表達(dá)與體壁中的規(guī)律類似,但其表達(dá)量較體壁同時(shí)期高。
　　 采用間接競爭ELISA技術(shù)分析了硫化物暴露下單環(huán)刺螠各組織(體壁、呼吸腸、肛門囊、中腸和體腔液細(xì)胞)中SQR的含量,結(jié)果顯示各組織SQR含量在25μM硫化物處理下與對(duì)照組相比均沒有顯著性差異;體壁SQR含量變化呈時(shí)間依賴特征,表現(xiàn)為50μ

8、M硫化物中處理12h時(shí)顯著性提高,24h達(dá)到最高,48h時(shí)降低;150μM硫化物處理2h時(shí)顯著性提高,隨著暴露時(shí)間的延續(xù),含量持續(xù)提高,并在48h時(shí)達(dá)到最高;呼吸腸SQR表達(dá)規(guī)律與體壁的類似,但對(duì)應(yīng)時(shí)間的含量更高;肛門囊SQR含量在50μM硫化物處理6h時(shí)顯著性提高,24h時(shí)達(dá)到最高,48h時(shí)顯著性降低,而150μM硫化物處理下與對(duì)照相比無顯著性差異;中腸SQR含量在硫化物處理后均未表現(xiàn)出顯著性提高;體腔液SQR含量在50μM組處理6h

9、時(shí)顯著降低,隨著時(shí)間延長,含量一直維持在較低水平。150μM組處理分別于2h、24h時(shí)呈顯著下降。
　　 對(duì)各組織在50μM硫化物處理下線粒體中SQR活性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示體壁、呼吸腸和肛門囊SQR酶活性變化均呈時(shí)間依賴的特征,且均在硫化物處理較短時(shí)間內(nèi)與對(duì)照組呈現(xiàn)顯著性提高(體壁2h;呼吸腸2h:肛門囊6h),處理24h達(dá)到最高,48h時(shí)較前期顯著降低。而中腸和體腔液只在硫化物處理48h時(shí)與對(duì)照相比顯著性提高。