單環(huán)刺螠纖溶酶的分離純化及其藥效學研究.pdf

1、血栓栓塞性疾病一直以來嚴重危害著人類的健康，不僅發(fā)病率高，而且死亡率和致殘率也很高，它主要危害心、腦，肺等血管系統(tǒng)，造成人死亡或者偏癱殘疾。全世界每年新增1500萬血栓性病人，在我國每年約有200多萬人死于心腦血管疾病，急需溶栓治療的病人超過500萬。因此，血栓性疾病藥物研發(fā)已經(jīng)成為當今全世界醫(yī)學界研究的重點。 應用溶栓劑進行溶栓治療是當前治療血栓性疾病的主要手段。雖然溶栓劑已發(fā)展了三代，但仍有諸多的副作用，如特異性降解纖維蛋白

2、能力低，易誘發(fā)機體出血等。因此，尋找和開發(fā)新型溶栓劑仍是治療血栓性疾病的重要內(nèi)容。鑒于海洋生物活性物質(zhì)自身其獨特的優(yōu)點，海洋生物逐漸成為新藥研發(fā)的珍貴資源。本實驗室經(jīng)多年研究，從海洋無脊椎動物單環(huán)刺螠(Urchis unicinctus)中尋找和分離出了一種新型纖溶酶，命名為單環(huán)刺螠纖溶酶(UFE)，并對其酶學性質(zhì)和藥效學活性展開相關(guān)研究，現(xiàn)將主要研究結(jié)果簡述如下： 1.單環(huán)刺螠體腔液經(jīng)分子量8，000Da截留超濾，Sephad

3、ex G-75，DEAE-52和Sephacryl S-100柱層析分離，獲得酶組分經(jīng)HPLC分析其純度為95％，SDS-PAGE電泳圖譜呈單一蛋白條帶。SDS-PAGE法測其相對分子質(zhì)量約為26kDa。酶純化倍數(shù)為10.2，回收率為13.9％。 2.對此酶進行相關(guān)酶學性質(zhì)的研究，結(jié)果表明UFE的最適反應溫度為50℃，最適反應pH為8.0；酶活力在pH6.0-9.0時相對穩(wěn)定；在20℃-50℃溫度范圍內(nèi)，具有良好的熱穩(wěn)定性。Mg

4、2+對酶的活性有促進作用，Cu2+、Fe3+. Ca2+、Zn2+、Fe2+、Ba2+等離子對酶活性均具有一定的抑制作用。以酪蛋白為底物，根據(jù)雙倒數(shù)作圖法，求得該酶的米氏常數(shù)Km=2.2mg/mL為，最大反應速率Vmax=41.15μg/min·mL。 3.UFE具有直接纖溶活性和激酶活性的雙重纖溶能力。以尿激酶標準品為參照，瓊脂糖纖維蛋白平板法標定UFE的總活力效價為每mg酶含2477.2個尿激酶活力單位，其中激酶活性為每mg

5、酶含1605.6個尿激酶活力單位，約占酶總活力的64.8％。 4.溶血性實驗，皮下出血實驗，全身過敏實驗證實，該酶具有良好的生物安全性。急性毒性實驗驗證UFE的半致死劑量LD50為571.36mg/kg，95％的可信限為531.83—623.21mg/kg，無毒性。 5.根據(jù)UFE降解纖維蛋白原產(chǎn)物分析，推測其為γ-纖溶酶。 6.體外溶栓實驗表明，UFE組3h時血栓溶解率達76.3％，與蚓激酶對照組有顯著性差異(

6、p<0.01)，具有直接溶解纖維蛋白的能力。 7. UFE可顯著延長APTT，PT，CT和TT值，具有明顯的抗凝效應，但其抗凝效應不作用于抑制血小板聚集這一環(huán)節(jié)。體內(nèi)頸動脈血栓各指標實驗表明，UFE可使ELT時間顯著縮短，纖維蛋白降解產(chǎn)物FDP含量增多，D-二聚體反應呈陽性，說明UFE使機體繼發(fā)性纖溶途徑明顯增強，提高了機體整體的纖溶活力。 綜上所述，UFE具有顯著的抗凝活性和纖溶活性，具有重要的臨床開發(fā)價值，值得深入研