豬核糖核酸酶L抗PRRSV活性及其機(jī)制初步研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗稱“豬藍(lán)耳病”，屬于一種高度接觸性傳染病，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是形成該病的病原，該病臨床表現(xiàn)為母豬妊娠期流產(chǎn)、返情、死胎及各年齡段豬不同程度的呼吸道癥狀。豬體感染PRRSV后豬體免疫抑制，先天免疫

2、應(yīng)答障礙，后天獲得性免疫緩慢，造成細(xì)菌或其他病毒的混合感染或繼發(fā)感染。嚴(yán)重阻礙了世界養(yǎng)豬業(yè)的進(jìn)步，制約全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展步伐。
　　RNase L(Ribonuclease L)是由干擾素(IFN)刺激產(chǎn)生的抗病毒蛋白(Antiviralprotein，AVP)，參與宿主的特異性免疫和非特異性免疫，在機(jī)體的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等過程中起著舉足輕重的作用。激活后的RNase L具有抑制RNA病毒和部分DNA病毒復(fù)制增殖的作用，通過研究發(fā)現(xiàn)

3、，豬的RNase L(sRNase L)對(duì)PRRSV在宿主內(nèi)的增殖也具有一定的抑制能力，激活后的sRNase L明顯降低了PRRSV的滴度。圍繞sRNase L抗PRRSV活性及其初步機(jī)制的探索，本論文開展了以下幾個(gè)方面的研究:
　　1.sRNase L真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)
　　根據(jù)GenBank中Sus scrofa RNase L基因序列全長(zhǎng)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，上游添加真核表達(dá)增強(qiáng)序列Kozak序列，下游添加HA標(biāo)

4、簽序列;利用Poly(I∶C)刺激，從PK-15細(xì)胞（豬腎上皮細(xì)胞）中擴(kuò)增sRNase L基因全長(zhǎng)。全長(zhǎng)目的基因sRNase L和真核表達(dá)載體pXJ41經(jīng)雙酶切后連接構(gòu)建pXJ41-sRNase L真核表達(dá)載體;重組表達(dá)載體經(jīng)雙酶切驗(yàn)證、測(cè)序分析正確后，Western blotting檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了表達(dá)sRNase L蛋白的真核表達(dá)載體。
　　2.PRRSV病毒量及IFN-β mRNA表達(dá)水平real-t

5、ime PCR檢測(cè)方法的建立
　　本研究利用PRRSV的N蛋白基因、IFN-β、管家基因GAPDH的基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物，并構(gòu)建含有PRRSVN蛋白基因的重組質(zhì)粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量檢測(cè)PRRSV N蛋白基因的拷貝數(shù)用以衡量PRRSV的病毒量;以2-△△Ct為基礎(chǔ)建立了IFN-β的相對(duì)定量檢測(cè)方法。兩種方法具有線性關(guān)系良好、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)兩種基因的檢測(cè)特異性強(qiáng)，擴(kuò)增片段呈現(xiàn)特異、單一的熔解峰;目的基因和內(nèi)參基

6、因片段的擴(kuò)增效率也比較高，因此，可以用來分析PRRSV病毒量及IFN-β mRNA的水平。
　　3.sRNase L抗PRRSV活性及其機(jī)制初步研究
　　RNase L在機(jī)體的抗病毒免疫過程中發(fā)揮著重要的作用，但sRNase L是否同樣具有抗PRRSV的活性尚未確定，本研究探索了2-5A+/-條件下sRNase L不同轉(zhuǎn)染量對(duì)PRRSV增殖的影響。發(fā)現(xiàn)sRNase L對(duì)PRRSV的增殖具有一定的抑制能力，經(jīng)過2-5A激活的s

7、RNase L能夠顯著降低PRRSV的滴度。間接免疫熒光也證實(shí)了PRRSVN蛋白的表達(dá)明顯降低，從而確定了sRNase L具有抗PRRSV的活性。進(jìn)一步通過IFN-βmRNA水平、ISRE啟動(dòng)子活性等的檢測(cè)初步探索了其抗病毒機(jī)制，MARC-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染pXJ41-sRNase L后，相對(duì)熒光定量PCR顯示IFN-βmRNA水平得到了明顯的提高，Luciferase試驗(yàn)表明ISRE啟動(dòng)子活性顯著提高，初步探索了sRNase L通過增強(qiáng)Ⅰ