探索脫氧核糖核酸酶I高敏感位點(diǎn)研究的新方法.pdf

1、脫氧核糖核酸酶I高敏感位點(diǎn)(DHSs)在過去超過28年的時(shí)間里被研究者發(fā)現(xiàn)能夠代表許多基因調(diào)控功能原件的位點(diǎn),這包括增強(qiáng)子,絕緣子,啟動(dòng)子和位點(diǎn)控制區(qū)域等。脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)高敏感區(qū)域一般具有活躍的順式調(diào)控序列特征。發(fā)現(xiàn)基因組中非編碼的功能原件對(duì)于理解復(fù)雜的基因表達(dá)有著重要意義。通過鑒定基因組上哪些區(qū)域?qū)τ贒NaseI酶切敏感是發(fā)現(xiàn)有活性的功能原件的一種方法。我們能夠通過研究DHSs,找到基因組的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域,進(jìn)而研究生物

2、的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。
　　在此,我們基于DNaseI-seq開發(fā)了一種新的方法,該方法能夠降低樣本起始量擴(kuò)大了該方法的應(yīng)用范圍,該方法利用瓊脂糖凝膠對(duì)DNA的保護(hù)作用降低DNA的損失,并且減少非酶切產(chǎn)生的DNA斷裂,從而增加了DNaseI的敏感性,減少噪音信號(hào),降低DHSs假陽性的可能性。為了解決樣本起始量的問題,我們利用了Phi29DNA聚合酶的多重鏈置換特性和強(qiáng)大的連續(xù)合成能力以及瓊脂糖凝膠內(nèi)的分子反應(yīng)。首先利用離子去垢劑破壞細(xì)胞

3、膜增加核膜的通透性,然后用脫氧核糖核酸酶I對(duì)細(xì)胞染色質(zhì)進(jìn)行酶切。通過控制酶切時(shí)間和酶濃度,我們控制產(chǎn)物片段分布在20-50kbp,因?yàn)镻hi29能對(duì)該大小的DNA片段進(jìn)行高效擴(kuò)增。酶切完成后我們加入等體積1.2％的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠,待瓊脂糖凝固后,大片段的DNA分子就被固定在凝膠內(nèi)防止機(jī)械損傷。之后將瓊脂糖凝膠塊浸泡在裂解液中過夜,讓DNA分子釋放出來。去除裂解液后,我們?cè)诃傊悄z內(nèi)對(duì)酶切后的DNA進(jìn)行末端修復(fù)和接頭連接。此過程中降低