雙胸蚓組織中核酸酶EWD-,1，2，3-的結(jié)構(gòu)、基因和相關性質(zhì)研究.pdf

1、山西醫(yī)科大學博士學位論文雙胸蚓組織中核酸酶EWD的結(jié)構(gòu)、基因和相關性質(zhì)研究姓名：于保鋒申請學位級別：博士專業(yè)：生理學指導教師：祁金順;牛勃20060520鍵有關，3 種蛋白的酸性等電點與多肽鏈中的酸性氨基酸含量較高有關。氨基酸組成比較顯示，該3 種酶與其它核酸酶較相似；4 ．用E d m a n 降解法對經(jīng)2 D —S D S —P A G E 進一步分離純化和轉(zhuǎn)膜的2 種雙胸蚓核酸酶的N 末端序列進行分析，膠內(nèi)酶切后用串聯(lián)質(zhì)譜( L

2、C —M S ／M S ) 對3 種核酸酶進行了序列分析，并采用M A L D I —T O F ，M S 法鑒定了3 種核酸酶蛋白中的二硫鍵數(shù)目和糖含量。結(jié)果顯示經(jīng)E d m a n 降解法測定，E W D ，蛋白大亞基的N 末端6 個氨基酸序列為：D 、E 、w 、V 、Y 、P ，E W D 2 蛋白的N 末端9 個氨基酸序列為：L 、L 、G 、P 、Y 、K 、P 、K 、C ：串聯(lián)質(zhì)譜的結(jié)果對數(shù)據(jù)庫進行搜索，沒有有意義的匹配

3、結(jié)果，也提示3 種核酸酶為新蛋白；M A L D I - T O F ．M S 法顯示1 號核酸酶中含有8 個半胱氨酸，形成4 對二硫鍵，2 號核酸酶中有6 個半胱氨酸，形成3 對二硫鍵，3 號核酸酶中含有2 個半胱氨酸，形成l 對二硫鍵。四、雙朐螞【c D N A 文庫的構(gòu)建和編碼雙胸蚓核酸酶的c D N A 序列的獲得： 1 ．反轉(zhuǎn)錄法結(jié)合重組D N A 技術，構(gòu)建了雙胸蚓的c D N A 文庫，并隨機挑取1 0 0 0 個克隆進行

4、測序，將測序結(jié)果用生物信息學的方法轉(zhuǎn)譯成隨機讀碼框架，以N 末端序列和質(zhì)譜序列進行了篩庫比較，未發(fā)現(xiàn)隨機挑選測序的5 6 0 個克隆中含有E W D s 的基因序列，但提示了E W D s的表達豐度較低，并給出了蚯蚓表達所需密碼子的偏愛性，為進一步的引物設計提供了依據(jù)。2 ．改用簡并引物R T - P C R 的方法，己獲得了編碼E W D 2 的c D N A 序列，并對克隆得到的編碼序列進行初步的序列分析，結(jié)果顯示，E W D 2

5、由5 2 8 個氨基酸殘基組成，氨基酸組成比例與酸水解法得到的結(jié)果基本一致，且其氨基酸序列中存在兩段氨基酸序列，經(jīng)比較顯示其與脊椎動物D n a s e I 的保守序列一致，由序列預測的等電點為4 ．8 ，與雙向電泳反應的等電點3 ．9 相近，由序列得到的分子量為5 8 2 6 3 ．2 8 ，與質(zhì)譜實測的分子量6 9 0 7 4 ．7 4 1 相差1 0 8 1 1 ．4 6 1 ，而前面測到其分子中含糖量為1 5 ．6 ％，正好對應

6、于這個差值。五、雙胸蚓核酸酶E W D 2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預測： 用傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜法測定了E W D 2 蛋臼的二級結(jié)構(gòu)組成，同時應用序列分析軟件G O R 和S C R A T C H 對克隆到的2 號核酸酶的氨基酸序列進行運算，預測2 號核酸酶的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示有1 0 段氨基酸序列形成o 【．螺旋的可能性較大。其含量豐富的疏水氨基酸組成特點及其二級結(jié)構(gòu)特征，表明其為～很穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。結(jié)論1 成功建立了高純度雙胸蚓核酸酶E

7、W D ∽．3 的純化方法。2 測定了3 種雙胸蚓核酸酶蛋白的分子量，E W D 】為1 5 7 1 9 1 D a ，E W D 2 為6 9 0 7 4 D a ，E W D 3 為6 3 4 6 1 D a ；得到了肽質(zhì)量指紋圖譜，證明其與已發(fā)現(xiàn)的蛋白及核酸酶結(jié)構(gòu)不同。3 ．測定了雙胸蚓核酸酶樣蛋白的氨基酸組成、N 末端序列、多肽鏈數(shù)量、二硫鍵含量、含糖量等一級結(jié)構(gòu)的內(nèi)容，為進一步進行基因序列研究奠定了基礎。串聯(lián)質(zhì)譜和與N C B