海洋高溫噬菌體非特異性核酸酶及溶原相關(guān)蛋白的性質(zhì)研究.pdf

1、隨著工業(yè)生產(chǎn)對(duì)熱穩(wěn)定生物催化需求的增加,嗜熱微生物作為有價(jià)值的酶的來源越來越引起人們的重視。本試驗(yàn)中,一種新的非特異性核酸酶GBSV1-NSN從海洋嗜熱細(xì)菌噬菌體GBSV1中第一次被發(fā)現(xiàn),它與已知的核酸酶氨基酸序列沒有明顯的同源性。GBSV1-NSN在Escherichia coli中重組表達(dá)純化后,呈現(xiàn)出非特異性核酸酶的性質(zhì),能夠降解各種類型的核酸,包括環(huán)狀雙鏈DNA、線狀雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA。核酸酶GBSV1-NSN的最適

2、反應(yīng)溫度是60℃,最適pH是7.5,它的活性被EDTA、2-ME、SDS、citrate、guanidine hydrochloride、urea和DTT抑制,相反被Tween20、Chaps和Triton X-100增強(qiáng)。它對(duì)不同的底物具有不同的Km,雙鏈DNA是231μmol/L,單鏈DNA是61μmol/L,RNA是92μmol/L。綜上所述,它的發(fā)現(xiàn)對(duì)于科學(xué)研究和應(yīng)用具有重要的意義。
　　 在深海嗜熱細(xì)菌噬菌體GVE2的

3、溶原性研究中,我們發(fā)現(xiàn)噬菌體GVE2開放閱讀框的排列模式與λ噬菌體有明顯的區(qū)別,二者之間裂解基因的排列順序相差較大,而且λ噬菌體中cⅠ基因和重組酶之間的距離較GVE2遠(yuǎn)。為了進(jìn)一步研究噬菌體GVE2的溶原性,我們克隆表達(dá)了溶原建立蛋白(特異位點(diǎn)重組酶VP462)以及溶原維持蛋白(CⅠ調(diào)控子)。
　　 通過Northern blot和Western blot對(duì)它們?cè)谒拗黧w內(nèi)的轉(zhuǎn)錄翻譯狀況進(jìn)行觀察,結(jié)果表明vp462從噬菌體感染宿主

4、后0.5h到6b均有轉(zhuǎn)錄表達(dá),而且以二聚體的形式在體內(nèi)存在,但是在宿主體外VP462蛋白在不同溫度下卻均以單體的形式存在。CⅠ蛋白從噬菌體感染宿主后0.5h到6h表達(dá)量逐漸加大,并且呈二聚體和四聚體形式,二聚體比四聚體多；但是GVE2感染宿主菌8h后,CⅠ大部分形成四聚體,這表明CⅠ維持溶原的能力增強(qiáng)。此外,CⅠ在宿主菌體內(nèi)與體外,大約從50℃開始會(huì)形成多聚體,這體現(xiàn)出嗜熱細(xì)菌噬菌體的部分蛋白只有在高溫環(huán)境下才會(huì)形成具有生物學(xué)功能形式的

5、特性。CⅠ在體外從pH5.0到pH10.5,60℃條件下具有降解自身的肽酶性質(zhì),此性質(zhì)與λ噬菌體中的CⅠ蛋白在體外堿性條件下降解自身的肽酶性質(zhì)相符合。
　　 通過ChIP我們尋找獲得CⅠ蛋白在GVE2基因組上的操縱基因,該基因位于cⅠ基因的啟動(dòng)子區(qū)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證以及找尋CⅠ蛋白控制溶原狀態(tài)的作用位點(diǎn),通過凝膠阻滯將ChIP找到的CⅠ的操縱基因以及其它五段預(yù)測(cè)的序列一一驗(yàn)證。結(jié)果顯示,CⅠ蛋白只與通過ChIP得到的序列結(jié)合,與其

6、它的預(yù)測(cè)序列均不結(jié)合,即CⅠ蛋白只與一個(gè)操縱基因結(jié)合,該操縱基因可能與立即早期轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相重疊。所以,GVE2的立即早期轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可能不同于λ噬菌體,它只從一個(gè)位點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄,而不是從兩個(gè)位點(diǎn)向相反的方向轉(zhuǎn)錄。
　　 λ噬菌體中Cro蛋白是打破溶原狀態(tài),使噬菌體向著裂解方向進(jìn)行的調(diào)控蛋白,它的閱讀框與cⅠ基因鄰近；在GVE2中,由于cⅠ基因的左側(cè)是重組酶,所以,試驗(yàn)cⅠ右側(cè)的ORF28(vp55)和ORF29(vp64)兩個(gè)未

7、知基因,先將其克隆表達(dá),但是只有ORF29(vp64)表達(dá),但是EMSA顯示ORF29(vp64)蛋白與CⅠ的操縱基因不結(jié)合。之后,用CⅠ的操縱基因去釣Cro,但是仍沒有釣到相應(yīng)的蛋白,推測(cè)GVE2中可能不存在Cro蛋白。在λ噬菌體中,CⅡ是控制溶原發(fā)生的早期調(diào)控蛋白,它調(diào)節(jié)重組酶啟動(dòng)子,但是在GVE2中用重組酶啟動(dòng)子DNA釣CⅡ,并沒有獲得預(yù)期的結(jié)果?？梢钥闯?GVE2與λ噬菌體在控制溶原的過程中可能有不同的調(diào)控機(jī)制,GVE2中可能不