GRP78參與腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞之間正反饋調(diào)節(jié)的機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是腫瘤微環(huán)境中重要的間質(zhì)細(xì)胞，主要表現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞的特征，能夠通過分泌多種細(xì)胞因子和蛋白酶，為腫瘤細(xì)胞創(chuàng)造一個利于其發(fā)展的微環(huán)境。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的應(yīng)激蛋白，由于腫瘤細(xì)胞處于缺氧、缺糖以及酸性的微環(huán)境，所以常常導(dǎo)致GRP78在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)，過量的GRP78能夠突破內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的限制，進(jìn)入細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞膜以及細(xì)胞的分泌物中，參與調(diào)控胞內(nèi)信號并影響腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫

2、瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　TAM是腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)腫瘤發(fā)展的重要影響因素，高表達(dá)的GRP78也從多個方面發(fā)揮促腫瘤作用，兩者在功能上具有相似之處;TAM受腫瘤微環(huán)境的招募和馴化常常聚集于腫瘤的缺氧部位，GRP78的高表達(dá)也常發(fā)現(xiàn)于腫瘤中心的缺氧區(qū)域，兩者在定位上有相似之處;TAM出現(xiàn)于腫瘤發(fā)展的中后期，而GRP78的高表達(dá)也是由腫瘤中后期的惡劣環(huán)境所致，兩者在出現(xiàn)的時間上具有相似之處;腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與GRP78在功能、空間和時間上的“

3、巧合”，預(yù)示著GRP78可能參與了腫瘤細(xì)胞與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞之間的相互調(diào)控。探明GRP78在其中發(fā)揮的作用以及調(diào)控機(jī)制，對腫瘤靶向藥物的開發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。本研究通過人巨噬細(xì)胞分化模型和GRP78分泌模型深入探究了TAM與GRP78的相互調(diào)控作用，并且針對GRP78在腫瘤細(xì)胞中的特性設(shè)計(jì)了靶向藥物。具體研究內(nèi)容如下:
　　第一部分:M2型巨噬細(xì)胞能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中GRP78高表達(dá)，而高表達(dá)的GRP78在M2型巨噬細(xì)胞的促腫瘤遷

4、移過程中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移的同時能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中GRP78高表達(dá)。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞分泌的CCL17和CCL22能夠與腫瘤細(xì)胞表面的CCR4受體結(jié)合，進(jìn)而激活下游的PI3K/Akt信號。p-Akt能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+通道蛋白IP3R的活性，使Ca2+在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生聚集，進(jìn)而促進(jìn)ATF-6的剪切以及入核，最終導(dǎo)致GRP78表達(dá)的升高。如果利用shRNA干擾技術(shù)敲低GRP78的表達(dá)

5、會明顯減弱M2型巨噬細(xì)胞的促遷移效應(yīng)。這部分研究結(jié)果，不僅表明高表達(dá)的GRP78在M2型巨噬細(xì)胞的促腫瘤遷移過程中發(fā)揮了重要作用，同時也突破了對“腫瘤的惡劣微環(huán)境是誘導(dǎo)GRP78高表達(dá)的主要原因”的一貫認(rèn)知，揭示了GRP78在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的新機(jī)制。
　　第二部分:腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的GRP78激活了自身的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的GRP78能夠與STAT3和JAK2形成蛋白復(fù)合物，從而拉近S

6、TAT3與JAK2的距離，促進(jìn)STAT3的磷酸化。p-STAT3能夠進(jìn)入細(xì)胞核并引起以IL-1β和TNF-α高表達(dá)為代表的腫瘤細(xì)胞自身炎癥反應(yīng)，而敲低IL-1β和TNF-α的表達(dá)也能夠明顯減弱M2型巨噬細(xì)胞的促遷移效應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了GRP78促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及惡化的新機(jī)制，還表明巨噬細(xì)胞可以通過誘發(fā)腫瘤細(xì)胞自身的炎癥反應(yīng)來維持腫瘤的炎癥微環(huán)境，為“腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的免疫抑制特性”和“腫瘤的炎癥微環(huán)境”之間的動態(tài)平衡提供了新的解釋。

7、
　　第三部分:腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的GRP78能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。高表達(dá)的GRP78能夠促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)和分泌，進(jìn)而激活Smad2/3信號，p-Smad2/3又能夠進(jìn)一步促進(jìn)Snail-2的表達(dá)，而Snail-2作為EMT過程的重要轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控了N-cadherin、Vimentin和E-cadherin等EMT關(guān)鍵標(biāo)志物的表達(dá)，最終誘發(fā)腫瘤細(xì)胞EMT。另外，高表達(dá)的GRP

8、78還激活了Fibronectin-integrin-β1-FAK信號，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附。這一發(fā)現(xiàn)闡明了GRP78通過改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移能力的新機(jī)制。
　　第四部分:腫瘤分泌型GRP78能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。利用濃度梯度的DLD1細(xì)胞培養(yǎng)基或者純化的GRP78蛋白處理RAW264.7細(xì)胞，能夠使RAW264.7細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的分化形態(tài)。進(jìn)一步的qRT-PCR、western blot和代謝組學(xué)檢測

9、發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GRP78處理后，RAW264.7細(xì)胞中M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（CD206、Arg-1和IL-10）的表達(dá)明顯升高，而M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（CD80、iNOS和IL-12）的表達(dá)沒有明顯的變化，同時細(xì)胞中的糖酵解代謝減弱，脂肪酸代謝明顯增強(qiáng)，表明經(jīng)GRP78處理后，RAW264.7細(xì)胞呈現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞特征。這一研究結(jié)果首次證明腫瘤細(xì)胞分泌型GRP78能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，通過改造微環(huán)境發(fā)揮促腫瘤作用。
　　第五部分

10、:針對GRP78構(gòu)建的GBP-SubA融合蛋白能夠靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的GRP78，進(jìn)而破壞細(xì)胞內(nèi)的GRP78，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。針對GRP78能夠特異存在于腫瘤細(xì)胞表面并且能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)展的雙重特性，構(gòu)建并表達(dá)純化了GBP-SubA融合蛋白。GBP-SubA能夠特異靶向腫瘤細(xì)胞表面GRP78，并破壞細(xì)胞內(nèi)GRP78，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。GBP-SubA不但針對GRP78單一分子實(shí)現(xiàn)了靶向和殺傷腫瘤細(xì)胞的雙重作用，而且還能通過影響腫瘤

11、微環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，極具開發(fā)潛力。
　　本研究表明，TAM能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中GRP78的高表達(dá)，高表達(dá)的GRP78一方面能夠通過刺激炎癥、促進(jìn)EMT、增強(qiáng)細(xì)胞與基質(zhì)的粘附，提高腫瘤細(xì)胞的遷移能力;另一方面能夠分泌到細(xì)胞外，促進(jìn)微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的M2型分化。在腫瘤細(xì)胞與TAM形成的正反饋調(diào)節(jié)中，GRP78發(fā)揮了重要作用。這一發(fā)現(xiàn)為以GRP78和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞為對象的研究提供新的思路。本研究中針對GRP78雙重特性的重組靶向藥物的