人GRP78在CHO細(xì)胞中的表達(dá)及功能鑒定.pdf

1、背景與目的：
　　葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是熱休克蛋白家族成員之一,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶。GRP78是未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)中的主要調(diào)節(jié)劑,能阻止壓力性傳感器的活化、維護(hù)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)、結(jié)合促凋亡分子,從而減少細(xì)胞程序性死亡。GRP78在缺氧、低血糖、酸化等微環(huán)境應(yīng)激條件引起的壓力性應(yīng)激中起著重要的作用。近來(lái)有研究提示氧化應(yīng)激以及血清剝奪等微環(huán)境應(yīng)激條件與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力性應(yīng)激反應(yīng)有著密切的關(guān)系。課題組前期工作證明,增加糖調(diào)節(jié)

2、蛋白78(GRP78)在胰島β細(xì)胞的表達(dá)不僅可以保護(hù)胰島β細(xì)胞抵抗STZ誘導(dǎo)的凋亡,同時(shí)還可誘導(dǎo)免疫負(fù)調(diào) T細(xì)胞的形成,參與免疫調(diào)節(jié),但其機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建人GRP78的真核表達(dá)質(zhì)粒,以及建立穩(wěn)定表達(dá)人GRP78的細(xì)胞系CHO-GRP78,研究氧化應(yīng)激、血清剝奪條件下,過(guò)表達(dá)的GRP78對(duì)CHO細(xì)胞凋亡以及存活率的影響,為進(jìn)一步研究其在細(xì)胞凋亡以及免疫調(diào)節(jié)中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.pIRES2-EGFP真

3、核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　運(yùn)用RT-PCR從胃癌細(xì)胞AGS中獲得人GRP78目的基因,以BamHⅠ為多克隆位點(diǎn)克隆至pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體。
　　2.穩(wěn)定表達(dá)pIRES2-EGFP/GRP78的CHO細(xì)胞系的建立
　　用LipofectamineTM2000將pIRES2-EGFP/GRP78質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞,經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,命名為CHO-GRP78。
　　3.CHO-GRP78細(xì)胞

4、中GRP78表達(dá)的鑒定
　　通過(guò)RT-PCR檢測(cè)GRP78 mRNA的表達(dá)。采用western blot檢測(cè)GRP78蛋白的表達(dá);采用共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GRP78蛋白的表達(dá)和分布。
　　4.細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　收集血清剝奪24h、48h的細(xì)胞,Annexin-APC和PI染色,FCM檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。
　　5.MTT法測(cè)細(xì)胞存活率
　　細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24h,無(wú)血清培養(yǎng)24h使細(xì)胞同步化,然后以

5、濃度為200μM、400μM、500μM、600μM的H2O2處理細(xì)胞4h誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。加入MTT培養(yǎng)4h,用490nm的波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.酶切鑒定以及DNA序列分析結(jié)果顯示 GRP78克隆以及PIRES2-EGFP/GRP78表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　2.RT-PCR結(jié)果顯示CHO-GRP78中GRP78 mRNA表達(dá)水平高于CHO細(xì)胞;western blot顯示CHO-GRP78細(xì)胞總蛋白以及上清

6、中GRP78蛋白的表達(dá)量高于CHO細(xì)胞,且CHO-GRP78中GRP78蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率以及平均熒光強(qiáng)度均高于CHO細(xì)胞;共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示GRP78主要定位于胞漿以及胞核中。
　　3.GRP78功能檢測(cè)
　　(1)過(guò)表達(dá) GRP78對(duì)血清剝奪誘導(dǎo)的CHO細(xì)胞凋亡的影響:CHO、CHO-GRP78無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h、48h后檢測(cè)細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示,24h、48h時(shí)CHO-GRP78細(xì)胞存活率均高于CHO細(xì)胞

7、,48h時(shí)CHO-GRP78的損傷率低于CHO細(xì)胞。
　　(2)過(guò)表達(dá)GRP78對(duì)不同濃度H2O2作用下CHO細(xì)胞存活率的影響:結(jié)果顯示在200μM、400μM、500μM的H2O2作用下 CHO-GRP78細(xì)胞存活率高于CHO細(xì)胞,在雙氧水濃度為400μM時(shí)差異性最為顯著;并且在一定范圍內(nèi)隨著H2O2濃度的升高,細(xì)胞的存活率呈梯度性下降。
　　結(jié)論：
　　pIRES2-EGFP/GRP78真核表達(dá)載體構(gòu)建成功,并且在