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文檔簡介
1、目的:葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78),又稱免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BIP),是熱休克蛋白70(HSP70)家族的重要成員。GRP78最初被發(fā)現在內質網中作為分子伴侶,對蛋白質的正確折疊組裝起著重要作用,而在腫瘤細胞中GRP78可以被誘導表達,進而促進腫瘤細胞的增殖、抗凋亡以及增加腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。近來發(fā)現GRP78不僅存在于細胞內內質網中,也可以轉移到細胞膜甚至可以分泌到細胞外,而分泌型GRP78作為腫瘤微環(huán)境的組成部分對腫
2、瘤的作用還不完全清楚。結合實驗室前期研究基礎,GRP78對免疫細胞特別對樹突狀細胞的生長分化具有重要的調節(jié)作用。本研究探討腫瘤細胞分泌的GRP78作為腫瘤微環(huán)境的組成部分,對腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞產生的影響。
方法:⑴利用PMA可以促進單核細胞THP1向巨噬細胞分化這一研究模型,研究GRP78對巨噬細胞極化的影響。提取純化原核表達蛋白GRP78與丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)共同刺激單核細胞THP1,并分組設立GRP78濃度梯度10
3、ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml,刺激72h后收集細胞用流式細胞儀檢測細胞表面標志CD163、FGL2。用Trizol提取細胞的RNA,利用RT-PCR方法檢測FIZZ1、IL10、TGFβ、ARG1和iNOS等分子的RNA表達。⑵設計與GRP78編碼序列互補的引物對,引入Xho I和Hind III酶切位點,取實驗室前期構建的人來源GRP78原核表達載體pGEX-4T-3-GRP78為模板,PCR擴增人GRP
4、78基因(去內質網滯留信號中的KDEL序列);將GRP78基因片段及PET42a空載質粒均用Xho I和Hind III酶切處理后經瓊脂糖凝膠電泳,回收帶有相同黏性末端的片段用T4連接酶進行連接,轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌,并挑取陽性菌落擴增提取質粒酶切鑒定,將酶切正確的質粒送公司測序,保留測序正確的質粒pET-42a-GRP78及菌種。同理,設計與GRP78編碼序列互補的引物對,引入6個His標簽及Pst I和BamH I酶切位點
5、,以前述pET42a-GRP78載體為模板,擴增目的基因。GRP78基因片段及pIRES2-EGFP空載質粒均用Pst I和BamH I酶切處理后回收帶有相同黏性末端的片段,用 T4連接酶連接,其他實驗步驟如前述,測序后保存pGIE質粒及菌種。⑶提取pGIE質粒,用Pst I限制性內切酶將質粒線性化并凝膠電泳回收。用Lipofectamine2000轉染試劑將回收的質粒轉染前列腺癌細胞DU145,用G418進行抗性篩選并進行單克隆化,在
6、熒光顯微鏡下觀察挑選出帶有綠色熒光的細胞進行擴大培養(yǎng),并進行多次傳代培養(yǎng)。對穩(wěn)定帶有熒光的細胞,進一步進行流式細胞術鑒定,并用Elisa檢測細胞上清中GRP78的分泌。選取分泌GRP78的細胞進行保存培養(yǎng)及后續(xù)的實驗。
結果:①GRP78刺激單核細胞THP1后,FCM檢測顯示CD163表達升高,且隨著GRP78刺激濃度升高而增加,RT-PCR檢測顯示在GRP78濃度為40ng/ml時FIZZ1、TGFβ有明顯的升高,FGL2的
7、表達則隨著GRP78濃度的增加而降低,而IL10、ARG1、iNOS的表達變化不明顯。②目的基因片段與pIRES2-EGFP空載體連接后,挑取篩選后藍白斑陽性菌落擴增并提取質粒,瓊脂糖凝膠電泳鑒定篩選出質粒大小符合理論值(約7kb)的質粒,酶切后電泳鑒定進一步篩選出符合預期大小的質粒樣品,測序結果與GRP78-?KDEL基因序列相符,所編碼氨基酸序列完全一致,結果表明pGIE真核核表達載體構建成功。③在熒光顯微鏡下,觀察轉染pGIE質粒
8、的DU145細胞形態(tài)及綠色熒光的表達,選取熒光強度較強的細胞進行單克隆化并繼續(xù)G418加壓篩選,選取熒光強度強的細胞擴大培養(yǎng),并用流式細胞儀進行綠色熒光檢測,收集轉染以及未轉染質粒的細胞上清ELISA檢測,ELISA檢測結果顯示轉染了pGIE質粒的DU145細胞上清中GRP78較未轉染的有明顯升高。
結論:⑴GRP78可以促進單核細胞THP1表面CD163、FIZZ1、TGFβ分子的表達,而抑制FGL2的表達,提示GRP78可
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