GRP78蛋白在腫瘤細(xì)胞自噬中的調(diào)控作用.pdf

1、細(xì)胞自噬是腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)微環(huán)境應(yīng)激的重要手段，保護(hù)腫瘤細(xì)胞在應(yīng)激條件下存活。在腫瘤細(xì)胞中自噬活化和GRP78蛋白高表達(dá)往往同時(shí)發(fā)生。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，缺糖引起的GRP78上調(diào)能夠誘導(dǎo)IKKβ以自噬-溶酶體途徑降解，但GRP78與自噬之間的調(diào)控關(guān)系還尚不明確。為了探究GRP78是否參與了腫瘤細(xì)胞自噬的調(diào)控以及調(diào)控的具體分子機(jī)制，將從以下幾方面進(jìn)行深入的研究：
　　1.在MCF-7細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP、GFP-GRP78表達(dá)質(zhì)粒，q

2、RT-PCR、western blot和免疫熒光染色檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、p62、VPS34、Beclin1和ATG5的變化。發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)GRP78能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生以及VPS34的表達(dá)。使用不同時(shí)期的自噬抑制劑能明顯抑制GRP78誘導(dǎo)的自噬過(guò)程。反之，用GRP78特異性shRNA敲低GRP78表達(dá)，能夠降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比率，并且降低葡萄糖饑餓引起的細(xì)胞自噬。
　　2.在過(guò)表達(dá)GRP78的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步敲減VPS34

3、表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GRP78引起的自噬受到抑制，表明GRP78可能通過(guò)激活VPS34蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。GST-Pulldown與免疫共沉淀表明GRP78與VPS34之間存在相互作用。通過(guò)截短突變分析，發(fā)現(xiàn)GRP78 C端154個(gè)氨基酸介導(dǎo)其與VPS34的相互作用。點(diǎn)突變模擬乙酰化分析發(fā)現(xiàn)靠近C端的K633Q突變能夠增強(qiáng)GRP78誘導(dǎo)的自噬及VPS34的表達(dá)量。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)GRP78能夠通過(guò)抑制microRNA-143來(lái)調(diào)節(jié)VPS34的表達(dá)。綜上，

4、GRP78可以通過(guò)上調(diào)VPS34的表達(dá)并與VPS34相互作用激活細(xì)胞內(nèi)的自噬反應(yīng)。
　　3.在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)VPS34，qRT-PCR和western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)VPS34后GRP78蛋白水平增加。分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性層面探討VPS34影響GRP78表達(dá)的分子機(jī)制。qRT-PCR和western blot檢測(cè)影響GRP78表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子ATF6和YY1，發(fā)現(xiàn)VPS34過(guò)表達(dá)導(dǎo)致ATF6的mRNA和蛋白水平均有明顯

5、增加。使用蛋白合成抑制劑CHX、蛋白酶體抑制劑MG132或自噬-溶酶體抑制劑BAF處理VPS34過(guò)表達(dá)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)VPS34通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑而非自噬-溶酶體途徑提高GRP78蛋白的穩(wěn)定性。免疫共沉淀進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)VPS34過(guò)表達(dá)導(dǎo)致GRP78的泛素化水平降低。相反，VPS34敲減則導(dǎo)致GRP78的表達(dá)降低，同時(shí)伴隨著ATF6的降低以及miR-143的升高。以上結(jié)果表明，VPS34可以通過(guò)影響GRP78的轉(zhuǎn)錄和蛋白穩(wěn)定性上調(diào)GRP78在腫