抑制GRP78表達(dá)對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)生長(zhǎng)的影響.pdf

1、目的：目前，囊型包蟲(chóng)病治療主要以外科手術(shù)為主。但在手術(shù)期間囊腔內(nèi)容物溢出是該病術(shù)后復(fù)發(fā)的最主要的原因，向包蟲(chóng)囊腔內(nèi)灌注局部化療藥物是阻止該病復(fù)發(fā)最常用的方法。本研究以體外培養(yǎng)的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)為研究對(duì)象，應(yīng)用小分子干擾RNA(small interfer RNA，siRNA)技術(shù)特異性下調(diào)GRP78(glucose regulated protein78)在細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)中的表達(dá)，探討特異性下調(diào)GRP78對(duì)體外細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的作用。

2、
　　方法：無(wú)菌獲取細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，運(yùn)用Western blot技術(shù)檢測(cè)原頭節(jié)中的GRP78蛋白表達(dá)。在證實(shí)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)中存在GRP78蛋白的基礎(chǔ)上，運(yùn)用電穿孔技術(shù)將siRNA-GRP78轉(zhuǎn)染至細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)內(nèi)，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組。用Western blot及RT-PCR技術(shù)檢測(cè)原頭節(jié)GRP78mRNA及GRP78蛋白表達(dá)水平。用0.1％的伊紅染色溶液按1:1比例加到樣品中，15分鐘后，在光學(xué)顯微鏡下根據(jù)顏色的變化觀察siRN

3、A-GRP78轉(zhuǎn)染不同時(shí)間原頭節(jié)的活力，活的原頭節(jié)顏色沒(méi)有變化，但是死的就會(huì)被染成紅色，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，并繪制原頭節(jié)活力曲線。SEM觀察原頭節(jié)表面超微結(jié)構(gòu)；用Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原頭節(jié)內(nèi)Caspase-3酶活性；Western blot檢測(cè)原頭節(jié)Caspase-12蛋白表達(dá)水平。TUNEL檢測(cè)siRNA-GRP78轉(zhuǎn)染后對(duì)原頭節(jié)凋亡的影響。
　　結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)顯示，siRNA-GRP78可降低細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)

4、GRP78mRNA表達(dá)水平。Western bolt檢測(cè)顯示，siRNA-GRP78可降低細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)GRP78蛋白表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，正常和對(duì)照組原頭節(jié)的形態(tài)和活力幾乎沒(méi)有改變，而siRNA-GRP78組原頭節(jié)活力下降約50.19%。隨著siRNA-GRP78轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，siRNA-GRP78對(duì)原頭節(jié)的生長(zhǎng)抑制作用越明顯。連續(xù)觀察，9d后siRNA-GRP78組原頭節(jié)死亡率達(dá)87.65%。掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)siRNA-G

5、RP78轉(zhuǎn)染初期，原頭節(jié)體表出現(xiàn)指狀突起、頂端體表出現(xiàn)皺縮，隨著作用時(shí)間的增加，漸出現(xiàn)頂突界面缺損，吸盤(pán)變形，蟲(chóng)體表面出現(xiàn)凹陷，指狀突起增多，甚至出現(xiàn)蟲(chóng)蝕樣損害。Caspase-3活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，較正常對(duì)照組，siRNA-GRP78轉(zhuǎn)染后可使原頭節(jié)的caspase-3酶活性增加。TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，siRNA-GRP78轉(zhuǎn)染后可促使原頭節(jié)發(fā)生凋亡。
　　結(jié)論：1.運(yùn)用RNAi技術(shù)可以特異性下調(diào)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)GRP78mRNA及蛋白