基于ALI的r-PA-SP-B的融合表達(dá)及功能研究.pdf

1、肺表面活性蛋白B（SP-B）來源于肺泡II型上皮細(xì)胞，是構(gòu)成肺表面活性物質(zhì)進(jìn)化最早、不可或缺的疏水性蛋白之一。其主要功能是促進(jìn)磷脂分子擴(kuò)散，增加單分子膜的穩(wěn)定性，提高脂質(zhì)-蛋白復(fù)合物的表面活性，具有調(diào)節(jié)肺泡氣液界面表面張力的功能。急性肺損傷（ALI）過程中炎癥因子會導(dǎo)致肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)、功能發(fā)生變化，表面活性物質(zhì)合成減少；而SP-B合成的減少、構(gòu)像的改變及活性的降低，會進(jìn)一步加重ALI的病理過程。重組瑞替普酶(r-PA)是第三代溶栓

2、藥物，能有效清除心、肺等部位血管中出現(xiàn)的凝血塊，r-PA與SP-B的融合蛋白能為ALI替補(bǔ)治療開發(fā)一個(gè)新型的基因工程藥物。
　　目的：在于構(gòu)建、表達(dá)r-PA與SP-B的融合蛋白，通過摸索SP-B融合表達(dá)的特性，使其既具有r-PA清除凝血塊的作用，又具有SP-B表面活性功能的特點(diǎn)，為ALI替補(bǔ)治療開發(fā)新型的基因工程藥物。
　　方法：⑴研究SP-B融合表達(dá)的特性。SP-B難以用常規(guī)氨基酸合成方法獲得，先通過合成成熟SP-B的基因

3、，構(gòu)建在質(zhì)粒pGEX4T-1上，將GST-tag與SP-B融合，后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用Western Blot檢測SP-B的表達(dá)，并純化GST/SP-B蛋白。⑵構(gòu)建r-PA/SP-B融合表達(dá)的載體。根據(jù)SP-B融合表達(dá)的特性，合成r-PA基因、r-PA/SP-B共表達(dá)基因，構(gòu)建在真核載體pEZ-M03上，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定、基因測序，而后轉(zhuǎn)染到CHO-K1細(xì)胞中，細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物采用Western Blot檢測。⑶r-PA/SP-B

4、的細(xì)胞熒光定位。培養(yǎng)CCL149細(xì)胞，考察陽離子脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的條件及其轉(zhuǎn)染效率之后，將融合表達(dá)載體通過轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入 CCL149細(xì)胞中，利用載體上攜帶的eGFP，結(jié)合DAPI核染與DiI細(xì)胞膜染色，明確r-PA與r-PA/SP-B在細(xì)胞中的定位。⑷基于ALI的r-PA/SP-B功能的研究。構(gòu)建急性肺損傷細(xì)胞模型，采用細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)，分析質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CCL149細(xì)胞后r-PA/SP-B融合蛋白與細(xì)胞膜磷脂結(jié)構(gòu)的相互作用關(guān)系，采用纖維蛋白

5、-瓊脂糖平板法測定融合蛋白中r-PA的酶活性。
　　結(jié)論：①采用較低溫度、延長時(shí)間的方法，N-端的GST-tag可與C-端的SP-B融合，有助于促進(jìn)重組SP-B在的可溶性表達(dá)，明確疏水性的SP-B能與親水性、分子量較大的標(biāo)簽融合表達(dá)。②利用分子生物學(xué)技術(shù)分別構(gòu)建了r-PA表達(dá)載體pEZ-rPA和r-PA/SP-B融合表達(dá)載體pEZ-rPA-SPB，且都在C端攜帶eGFP報(bào)告基因，利用酶切鑒定、基因測序等方法分析、證明了載體構(gòu)建正確

6、。經(jīng)SDS-PAGE和 Western Blot檢測，表達(dá)產(chǎn)物可與r-PA抗體、SP-B抗體呈陽性反應(yīng)，產(chǎn)物中存在r-PA蛋白和r-PA/SP-B融合蛋白。③pEZ-rPA表達(dá)的綠色熒光蛋白在CCL149細(xì)胞中的分布主要集中在細(xì)胞胞漿，pEZ-rPA-SPB表達(dá)的綠色熒光蛋白在CCL149細(xì)胞中的分布主要集中在細(xì)胞膜上，說明r-PA/SP-B融合蛋白在CCL149細(xì)胞中有特異性表達(dá)，并且融合蛋白上的SP-B能發(fā)揮其在細(xì)胞膜上的定位及功能

7、。④篩選出適用于制備細(xì)胞損傷模型的LPS最優(yōu)劑量----終濃度為10ug/L；在LPS細(xì)胞損傷模型中，r-PA、r-PA/SP-B融合蛋白在細(xì)胞中的正常表達(dá)及功能沒有明顯受到LPS的影響，SP-B也沒有失去膜結(jié)合能力。⑤通過r-PA/SP-B在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中的表達(dá)，r-PA的酶活性為3.80，r-PA/SP-B融合蛋白的酶活性為3.42。可以利用SP-B具有膜結(jié)合性的特點(diǎn)，維持細(xì)胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，減少LPS等促炎因子對肺