Resilin-R4融合蛋白表達(dá)純化性能研究.pdf

1、Resilin-R5融合蛋白是將天然超強(qiáng)彈性蛋白R(shí)esilin和硅沉積肽R5線(xiàn)性連接形成的人工嵌段高分子。其中，Resilin是一類(lèi)具備超強(qiáng)彈性的生物蛋白，在一些昆蟲(chóng)外骨骼，飛行系統(tǒng)，發(fā)聲系統(tǒng)等有著廣泛的分布，交聯(lián)后的Resilin所具備的超高彈性以及變性復(fù)原能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通橡膠，在材料學(xué)、醫(yī)學(xué)和組織工程等領(lǐng)域具備很高的潛在應(yīng)用價(jià)值。R5肽來(lái)自硅藻（Cylindrotheca fusiformis細(xì)胞壁中silaffin前體多肽C端的

2、由19個(gè)氨基酸構(gòu)成的功能單位，能夠誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)硅藻中二氧化硅的沉積作用。其所展示的體外二氧化硅沉積性能，能獲得具有不同形態(tài)學(xué)特征的拱形結(jié)構(gòu)和細(xì)長(zhǎng)纖維結(jié)構(gòu)，暗示了其在納米材料等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　 本論文為了獲得兼具“高彈性”和“硅沉積”性能的新型功能生物材料，將具有高彈性的Resilin蛋白與具有硅沉積作用的R5肽進(jìn)行了融合，研究了其在大腸桿菌中的表達(dá)，及純化方法。首先，將果蠅彈性蛋白基因CG15920序列與硅藻R5肽基因序

3、列進(jìn)行拼接，經(jīng)過(guò)稀有密碼子優(yōu)化后合成重組基因resilin-r5。然后將其插入原核表達(dá)載體pET28a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS獲得表達(dá)菌株，并通過(guò)IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)將resilin-r5插入到載體pUC57后轉(zhuǎn)化E.coli△clpX，E.coliBW25113，E.coli DH5α等大腸桿菌菌株比較不同菌株的表達(dá)差異，以期獲取更高的目標(biāo)蛋白表達(dá)量。最后以鹽析加熱法和Ni離子柱親和層析法純化帶組氨酸標(biāo)簽的重組

4、融合蛋白。最終實(shí)現(xiàn)Resilin-R5融合蛋白的高效表達(dá)，產(chǎn)量達(dá)到120mg/L發(fā)酵液。并采用6×His標(biāo)簽Western blot和蛋白質(zhì)C端測(cè)序，證實(shí)所獲得融合蛋白為全長(zhǎng)目標(biāo)蛋白R(shí)esilin-R5。
　　 進(jìn)一步將Resilin-R5與天然陽(yáng)性多糖-殼聚糖按一定比例共混，制備了系列Resilin-R5/殼聚糖共混復(fù)合膜材料。對(duì)復(fù)合膜材料的溶脹性能、透氣性、吸水率、保水率、光催化交聯(lián)性能、二氧化硅沉積性能和力學(xué)性能進(jìn)行了測(cè)試

5、;并采用傅立葉變換紅外光譜分析、差示掃描量熱分析和顯微觀察對(duì)復(fù)合膜內(nèi)部基團(tuán)間相互作用、共混性能和膜形貌進(jìn)行了測(cè)試分析。結(jié)果表明，伴隨Resilin-R5比例升高，復(fù)合膜溶脹比呈逐步下降趨勢(shì)，最低溶脹比約為純殼聚糖膜的50％;當(dāng)Resilin-R5比例分別為7％和33％時(shí)復(fù)合膜透氣性較高，分別達(dá)到403g/m2·24h和392 g/m2·24h，均顯著高于純殼聚糖膜;復(fù)合膜的吸水率和保水率伴隨Resilin-R5比例升高呈升高趨勢(shì)，最高分

6、別達(dá)到264％和231％，均顯著高于純殼聚糖膜;復(fù)合膜形貌表現(xiàn)為多微球聚集膜材料，經(jīng)光催化后能夠形成紫外下發(fā)射藍(lán)色熒光的交聯(lián)體，并能催化硅酸甲酯水解在膜表面或內(nèi)部形成顆粒狀沉積物;當(dāng)Resilin-R5比例為13％時(shí)，復(fù)合膜具有最高拉伸長(zhǎng)度和最高拉斷強(qiáng)度，分別為41.6％和32.1MPa，顯著高于純殼聚糖;傅立葉變換紅外光譜和差示掃描量熱分析結(jié)果表明，Resilin-R5與殼聚糖間存在相互作用，且當(dāng)Resilin-R5比例低于20％時(shí)，