熱休克蛋白Sse1的表達純化以及生化性質研究.pdf

1、熱休克蛋白作為分子伴侶，是在細菌到哺乳動物中廣泛存在的一類高度保守的蛋白質，參與蛋白質的折疊，組裝以及跨膜轉運，并且能夠防止蛋白質的變性、凝聚以及促進變性蛋白的分解代謝。熱休克蛋白110(Heat shock proteins110，Hsp110)作為Hsp70(Heat shock proteins70，Hsp70)的同源蛋白，是一類在真核生物中豐富表達的蛋白質，能在哺乳動物組織尤其是哺乳動物大腦中高度表達。作為Hsp70蛋白功能所必

2、需的核苷酸交換因子(Nucleotide Exchange Factor，NEFs)，Hsp110在防止變性蛋白凝聚方面顯示出了較Hsp70更高的活性，然而其并不具備類似Hsp70的促進蛋白質折疊的活性，因此Hsp70被稱為折疊酶(foldase)，而Hsp110被稱為持家酶(holdase)。
　　Hsp110在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中有Sse1(Yeast Stress SeventyPr

3、otein1)和Sse2（Yeast Stress Seventy Protein2）兩種主要形式，其中Sse1是酵母在正常生長條件下表達的主導蛋白，而在諸如熱激等條件下，Sse1被進一步誘導表達的同時，Sse2也會被誘導表達。同時Sse1也具備加快Hsp70核苷酸交換速度的作用。Sse1最先作為鈣調蛋白結合蛋白從釀酒酵母中分離出來，其晶體結構已得到解析，因此Sse1常被用作研究Hsp110的模型。
　　為了研究Sse1底物結合結

4、構域的主要功能位點，本實驗室依據(jù)Sse1與Hsp70的結構同源性，首先在野生型Sse1的主要功能區(qū)域(底物結合結構域，Substrate BindingDomain，SBD)進行了8個位點的突變:Sse1-loop12，Sse1-loop23，Sse1-loop34，Sse1-loop45，Sse1-loop56，Sse1-loop67，Sse1-loop78，Sse1-G466PG472P，通過DNA測序鑒定正確后，對其進行表達純化。

5、然后通過熒光偏振技術對突變型Sse1和野生型Sse1的底物結合能力進行了比較。進而通過酵母體內生長實驗，從酵母生長表型上探究不同Sse1突變體對酵母表型的影響。最后通過蛋白質免疫印跡技術檢測酵母中Sse1的表達情況，以探究這些突變對酵母表型的影響是否源自蛋白功能的喪失。
　　實驗表明，相較于野生型Sse1，Sse1-loop12和Sse1-loop78的底物親和性無明顯變化，且其表型也與野生型相一致，只有Sse1-loop45雖然