IL1Rα-HSA融合蛋白高表達(dá)菌株發(fā)酵工藝的優(yōu)化.pdf

1、白介素1受體拮抗劑（IL-1Rα）是具有特異性的天然拮抗劑分子，在臨床上主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，近些年的一些研究結(jié)果表明IL-1Rα對(duì)Ⅱ型糖尿病有著明顯的治療效果。但是由于其分子量小，在體內(nèi)的半衰期只有4-6h，不利于臨床上的廣泛應(yīng)用，因此開發(fā)長效的白介素1受體拮抗劑就顯得極為重要。人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是近幾年來應(yīng)用最為廣泛的延長小分子蛋白半衰期的載體，2014年4月15日，美國FDA批準(zhǔn)了

2、英國葛蘭素史克公司用于治療Ⅱ型糖尿病albiglutide注射液（阿必魯泰，商品名:Tanzeum）上市，阿必魯泰是DPPIV耐受的GLP-1和重組HSA的融合蛋白，半衰期可以達(dá)到4至7天，適合一周一次甚至每兩周一次的給藥間歇，是世界上首個(gè)由FDA批準(zhǔn)的HSA融合蛋白的生物藥物，阿必魯泰的上市給更多的HSA融合蛋白藥物上市帶來了新的希望和動(dòng)力。
　　本研究以pPIC9為表達(dá)載體將IL-1Rα基因和HSA基因融合后在畢赤酵母中表達(dá)，

3、成功表達(dá)得到的融合蛋白IL-1Rα/HSA半衰期較IL-1Rα延長了約20倍，藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)得到了明顯的改善。將此單拷貝菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，融合蛋白表達(dá)量只有100 mg/L左右，表達(dá)水平較低。無論是從后期臨床研究的需求還是從經(jīng)濟(jì)效益考慮都需要提高蛋白的表達(dá)水平，我們首先考慮在遺傳水平對(duì)宿主進(jìn)行改造，通過增加目的基因拷貝數(shù)以及與分子伴侶共表達(dá)，使融合蛋白在搖瓶水平上的表達(dá)量由原來的100 mg/L提高到400 mg/L，提高了約四倍。但

4、是將此高表達(dá)菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵時(shí)，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)融合蛋白表達(dá)水平不但沒有提高，和原始菌株相比表達(dá)水平反而降低，而且融合蛋白出現(xiàn)了很嚴(yán)重的降解現(xiàn)象。針對(duì)這些問題，本實(shí)驗(yàn)主要通過響應(yīng)曲面優(yōu)化方法（Response Surface Methodology）對(duì)高表達(dá)菌株進(jìn)行發(fā)酵工藝的優(yōu)化。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴搖瓶及高密度發(fā)酵水平上對(duì)培養(yǎng)條件的初步摸索。在高密度發(fā)酵過程中影響蛋白表達(dá)的因素很多，如培養(yǎng)基的組成、pH、溫度、甲醇流加方式等

5、，如果將這些因素均在高密度發(fā)酵的水平上進(jìn)行摸索，試驗(yàn)周期會(huì)很長，因此我們首先在搖瓶水平上進(jìn)行初步的摸索，確定了pH、溫度以及在工業(yè)培養(yǎng)基中添加一定量的酵母提取物、蛋白胨、生物素、表面活性劑等均為對(duì)蛋白的表達(dá)有影響的因素。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行高密度發(fā)酵的初步探索，確定了在最佳的培養(yǎng)基添加成分1％酵母提取物、20％溶氧以及較高的甲醇補(bǔ)加速率下蛋白的表達(dá)水平有著顯著的提高。通過以上實(shí)驗(yàn)摸索確立發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成成分以及RSM優(yōu)化的三個(gè)因素pH、溫

6、度、甲醇補(bǔ)加速率。⑵響應(yīng)曲面法優(yōu)化OE-Strain表達(dá)條件。通過響應(yīng)曲面法進(jìn)行發(fā)酵工藝的優(yōu)化是目前最常用于發(fā)酵工藝優(yōu)化的方法，響應(yīng)曲面法的優(yōu)點(diǎn)是在試驗(yàn)條件優(yōu)化過程中可以連續(xù)地對(duì)試驗(yàn)因素的各個(gè)水平進(jìn)行分析，克服了正交試驗(yàn)只能對(duì)一個(gè)個(gè)孤立的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析和不能給出直觀圖形的缺陷，所以響應(yīng)曲面法被廣泛應(yīng)用于試驗(yàn)設(shè)計(jì)與工藝優(yōu)化研究。通過響應(yīng)面優(yōu)化法確立了最佳的培養(yǎng)條件pH7.0、T=29℃、Vm=4.81mL/L/h，在此最佳的培養(yǎng)條件下，蛋