喉癌中SP100表達及生物學功能研究.pdf

1、前言
　　 喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤,發(fā)病率約占全身腫瘤的1-5％,并且發(fā)病率呈不斷增長的趨勢:北美每年有13000例患者被診斷為原發(fā)性喉癌；在我國,喉癌的發(fā)病率在呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤中占據(jù)第二位,華北、東北地區(qū)是喉癌的高發(fā)區(qū)。手術(shù)是目前治療的主要手段,盡管早期喉癌患者的生活質(zhì)量由于喉部分切除術(shù)的應用得到了較大的改善,但晚期喉癌患者的生活質(zhì)量及生存率在最近的30年中無明顯變化。喉癌發(fā)生的病理分子機制仍不清楚,探討其發(fā)生、發(fā)展的分子

2、機制無論對喉癌的早期診斷,還是有效治療都具有重要意義。在前期的工作中,我們發(fā)現(xiàn)在喉癌組織中表達下調(diào)的SH3GL2蛋白在喉癌細胞系中可以和SP100蛋白結(jié)合而相互作用,提示SP100蛋白可能與喉癌的發(fā)生和進展相關(guān),在喉癌發(fā)生演進中發(fā)揮一定的作用。
　　 SP100蛋白,全名為SP100核抗原(SP100 nuclear antigen),屬早幼粒白血病核小體(promyelocytic Leukaemia nuclear body

3、,PML NBs)相關(guān)蛋白家族成員,含有SP100HMG、SP100A、SP100B和SP100C四種異構(gòu)體。4種SP100蛋白異構(gòu)體在氨基端共享同源SP100結(jié)構(gòu)域,不同異構(gòu)體在羧基端的SAND、PHD(planthomeodomain zinc finger)、Bromo或HMG(High Mobility Group,高遷移率組)結(jié)構(gòu)域存在差別。SP100蛋白己被證實參與病毒感染、病毒相關(guān)蛋白相互作用、自身泛素化調(diào)節(jié),并在干擾素、

4、p53等多個信號通路中發(fā)揮作用。目前有關(guān)其在人體腫瘤中的研究尚未見報道。
　　 在本研究中,我們將明確SP100基因在不同腫瘤細胞系及喉癌大體組織標本中的表達方式。同時,深入研究SP100HMG的生物學功能及其與SH3GL2蛋白的相互作用方式。一方面可為闡明SP100基因在喉癌發(fā)生和發(fā)展過程中的分子機制創(chuàng)造條件并提供新的線索,另一方面為開展以SP100HMG為靶點或通過蛋白相互作用設(shè)計競爭性抑制劑的喉癌診斷和治療奠定基礎(chǔ)。

5、>　　 材料與方法
　　 通過半定量PCR和實時定量PCR分別檢測SP100基因mRNA在人喉癌Hep2細胞系、人宮頸癌HeLa細胞系、人肝癌Bel細胞系、人胃癌SGC7901和BGC823細胞系、人胚腎HEK293細胞系和胎兒胃上皮GES細胞系中的表達情況。選取2004年1月-006年12月于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科診斷為喉鱗狀細胞癌的病例96例,收集喉癌組織及癌旁黏膜組織標本及相應病例臨床資料,采用RT-PCR、

6、Western Blot和免疫組織化學方法研究SP100基因在喉癌大體組織標本中表達情況,應用統(tǒng)計學方法分析臨床病理資料與SP100表達間的關(guān)系。
　　 通過RT-PCR分析SP100HMG轉(zhuǎn)錄本在人喉癌Hep2細胞系、人宮頸癌HeLa細胞系、人肝癌Bel細胞系、人胃癌SGC7901細胞系、BGC823細胞系、MKN細胞系、人胚腎HEK293細胞系和胎兒胃上皮GES細胞系中的表達情況；構(gòu)建RFP-SP100HMG表達載體,轉(zhuǎn)染H

7、ep2細胞,通過Western blot和RT-PCR檢測Hep2細胞中SP100HMG表達水平,同時觀察轉(zhuǎn)染后細胞形態(tài)學、細胞增殖能力、細胞體外侵襲能力和細胞凋亡水平的變化,綜合分析SP100HMG在喉癌細胞中的生物學功能。通過免疫共沉淀技術(shù)和免疫熒光技術(shù)分析SP100HMG和SH3GL2蛋白結(jié)合及區(qū)域定位；通過生物信息學技術(shù)對SP100HMG-SH3GL2結(jié)合區(qū)域進行預測,構(gòu)建該結(jié)合區(qū)域肽鏈表達載體、通過免疫共沉淀對SP100HMG

8、-SH3GL2的蛋白結(jié)合區(qū)域進行驗證,進一步揭示其參與蛋白質(zhì)間結(jié)合的肽鏈片段。
　　 結(jié) 果
　　 1、半定量和實時定量RT-PCR結(jié)果表明Hep2、HeLa、Bel、SGC7901、BGC823腫瘤細胞系中SP100 mRNA水平較黏膜上皮細胞系GES降低；
　　 2、RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,喉癌組織中SP100 mRNA和蛋白表達水平均低于癌旁對照組織,蛋白表達下調(diào)水平與mRNA表達下

9、調(diào)水平一致；
　　 3、免疫組織化學分析SP100蛋白表達位于細胞核和細胞質(zhì),蛋白表達水平與喉癌細胞病理分化程度相關(guān),低水平表達時SP100蛋白從細胞核向細胞質(zhì)移位；
　　 4、RT-PCR結(jié)果顯示在Hep2、HeLa、Bel、SGC7901、BGC823、MKN腫瘤細胞系中SP100HMG mRNA水平較黏膜上皮細胞系GES降低；
　　 5、RFP-SP100HMG表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep2細胞后,細胞中SP100蛋

10、白表達水平顯著增加,RT-PCR顯示SP100HMG表達水平亦顯著增加:
　　 6、SP100HMG對人喉癌Hep2細胞生物學行為的影響:RFP-SP100HMG表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep2細胞可以觀察到明亮的紅色熒光蛋白表達,轉(zhuǎn)染細胞形態(tài)明顯變圓、邊緣變鈍,細胞凋亡率增高、侵襲力顯著降低,細胞增殖水平較對照組細胞無明顯變化；
　　 7、免疫共沉淀顯示SP100HMG和SH3GL2在Hep2細胞內(nèi)結(jié)合,免疫熒光顯示SP100HM

11、G定位于細胞核,SH3GL2定位于細胞核和細胞質(zhì),二種蛋白結(jié)合區(qū)域定位于細胞核；
　　 8、生物信息學預測并經(jīng)免疫共沉淀實驗證實SP100HMG蛋白與SH3GL2蛋白結(jié)合位點位于SAND-HMG區(qū)域。
　　 結(jié) 論
　　 1、SP100 mRNA在多個惡性腫瘤細胞系中表達下調(diào),參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展；
　　 2、喉癌組織中SP100在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上表達下調(diào),是潛在的喉癌相關(guān)的抑癌基因；
　　 3、喉

12、癌組織中SP100蛋白表達水平、細胞內(nèi)分布狀況在不同分化程度癌細胞中存在顯著差異性,提示在喉癌的不同階段可能發(fā)揮不同的作用；
　　 4、SP100HMG在不同腫瘤細胞系中表達水平較正常黏膜上皮細胞系表達下調(diào),在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用；
　　 5、SP100HMG具有抑制喉癌細胞侵襲并增強細胞凋亡的能力,是喉癌相關(guān)的重要候選腫瘤抑制基因；
　　 6、SP100HMG通過SAND-HMG結(jié)構(gòu)域與SH3GL2