SP-B蛋白在ES小鼠中的表達分析.pdf

1、小鼠胚胎干(Embryonic stem，ES)細胞與四倍體胚胎有不同的發(fā)育潛能，四倍體胚胎僅參與卵黃囊內(nèi)胚層和胎盤滋養(yǎng)細胞譜系(如絨毛膜外胚層、滋養(yǎng)巨細胞等)的生成，而ES細胞廣泛參與胚體、羊膜、尿囊、卵黃囊中胚層和絨毛膜中胚層的生成，不參與卵黃囊內(nèi)胚層和胎盤滋養(yǎng)細胞譜系的生成。利用四倍體胚胎補償技術(shù)就可以得到完全由ES細胞發(fā)育而來的小鼠。 包括ES小鼠在內(nèi)的許多克隆動物都死于呼吸衰竭，呼吸衰竭征是指新生有活力的ES小鼠(有短

2、暫的呼吸現(xiàn)象)在出生后立刻表現(xiàn)進行性呼吸困難、皮膚青紫，其壽命不會超過1小時，肺部病理表現(xiàn)為肺泡擴張不全和肺泡壁增厚，而且，這種呼吸衰竭征是導(dǎo)致新生ES小鼠死亡的主要疾病。這種新生ES小鼠呼吸衰竭征的臨床和病理表現(xiàn)與人類兒科醫(yī)學(xué)中的新生兒呼吸窘迫綜合征(Neonatal respiratory distress syndrome，NRDS)非常相似，NRDS是由于肺表面活性蛋白(Surfactant protein，SP)缺乏導(dǎo)致肺泡塌

3、陷而引起的，現(xiàn)已在小鼠發(fā)現(xiàn)4種SP:SP-A、SP-B、SP-C、SP-D。在研究四種SP功能過程中發(fā)現(xiàn)SP-B基因打靶小鼠和因突變而導(dǎo)致SP-B基因缺失的新生兒在出生后都很快死于呼吸衰竭，所以SP-B對于維持肺泡的正常功能起著關(guān)鍵作用。據(jù)此我們推斷:新生克隆動物的呼吸衰竭征很可能是由于SP-B的異常表達引起的。 酚提法提取12只成年ES小鼠的12種組織(肺、肝、腦、胰、腸、膀、胃、心、睪丸或卵巢、脾、腎、肌肉)和7只新生死亡E

4、S小鼠的4種組織(心、肝、腦、肌肉)的DNA，選取5個微衛(wèi)星位點D2Mit493、D10Mit134、D5Mit138、D16Mit189和D5Mit346，進行PCR擴增，檢測19只ES小鼠的組織嵌合度，結(jié)果表明19只ES小鼠完全由ES細胞發(fā)育而來。 取1只死于呼吸衰竭的新生ES小鼠的肺臟，做常規(guī)組織切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡觀察其病理變化。和對照組相比，發(fā)現(xiàn)死于呼吸衰竭的新生ES小鼠的肺泡明顯擴張不全，且肺泡壁增厚。

5、 分別取12只成年ES小鼠、6只死于呼吸衰竭的新生ES小鼠及成年對照小鼠和新生對照小鼠的肺組織，裂解液充分消化，離心后取上清即為提好的蛋白。用免疫印跡法，即Western blot檢測SP-B蛋白的表達，結(jié)果表明成年ES小鼠肺臟組織中的SP-B表達減少，即使那些外表正常的成年ES小鼠，其SP-B的表達也明顯低于對照組成年小鼠，而在死于呼吸衰竭的ES小鼠中，沒有檢測到SP-B的表達，這些結(jié)果說明，呼吸衰竭征很可能是由于SP-B的嚴(yán)重表