miR-183負調(diào)控下游靶基因PTPN4促進肺腺癌始動細胞侵襲遷移作用的研究.pdf

1、目的:
　　1.基于紫杉醇結(jié)合無血清培養(yǎng)獲取CD133+/CD326+A549CSLCs并驗證miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的表達。
　　2.探討miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的作用。
　　3.初步闡明miR-183調(diào)控CD133+/CD326+A549CSLCs侵襲轉(zhuǎn)移的機制。
　　方法:
　　一.miR-183在CD133+/CD326+A

2、549CSLCs中的表達
　　1.通過課題組前期逆向誘導聯(lián)合藥物篩選富集肺腺癌始動細胞的實驗方法分離培養(yǎng)CD133+/CD326+A549CSLCs;應用流式熒光檢測技術(shù)檢測CD133+/CD326+ A549CSLCS比例;進行激光共聚焦方法直觀觀測CD133和CD326分子標記在富集細胞中的表達。
　　2.應用實時定量PCR技術(shù)檢測普通A549細胞和CD133+/CD326+ A549CSLCs中miR-183的表達情況

3、。
　　二.miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的作用
　　1.通過構(gòu)建miR-183慢病毒過表達和干擾載體，首先根據(jù)基因序列設計并合成互補oligo DNA，經(jīng)過退火、連接將目的片段連接至pcDNA6.2-GW/EmGFP質(zhì)粒上，經(jīng)過轉(zhuǎn)化后挑取3個克隆，搖菌抽提質(zhì)粒后進行測序，驗證pcDNA6.2-GW/EmGFP-mi-183重組克隆中插入片段序列與設計的寡聚單鏈DNA序列一致;使用Invitr

4、ogen公司的BP重組系統(tǒng)將目的片段重組到載體pDONR221上，從平板挑取陽性克隆并測序驗證，所得結(jié)果符合設計要求;最后用構(gòu)建的慢病毒表達載體和重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝病毒，組裝成pLenti6.3-anti-miR-183，收集病毒原液，超速離心濃縮，并通過測定方法獲得病毒滴度。經(jīng)過測序結(jié)果顯示，我們成功構(gòu)建了pLenti6.3-miR-183和pLenti6.3-anti-miR-183慢病毒載體，并得到了較為準確的病毒滴

5、度值，為后續(xù)實驗研究奠定了基礎。
　　2.通過轉(zhuǎn)染實驗構(gòu)建miR-183過表達和干擾的CD133+/CD326+A549CSLCs，實時定量PCR檢測miR-183在轉(zhuǎn)染慢病毒載體的CD133+/CD326+A549CSLCs中的表達。
　　3.裸鼠體內(nèi)成瘤實驗，并通過生物熒光技術(shù)檢測裸鼠肺部形成轉(zhuǎn)移瘤熒光強度;CCK8檢測miR-183過表達組CD133+/CD326+A549CSLCs增殖效應;體外Transwell實驗

6、檢測miR-183過表達或低表達的CD133+/CD326+A549CSLCs的遷移和侵襲現(xiàn)象。
　　三.miR-183調(diào)控CD133+/CD326+A549CSLCs侵襲遷移的作用機制
　　1.基于生物信息學預測分析平臺，預測miR-183下游靶點;雙熒光素酶基因報告載體系統(tǒng)間接驗證miR-183下游靶基因PTPN4; qRT-PCR和westernblot直接驗證經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染低表達miR-183的CD133+/CD326

7、+A549CSLCs中PTPN4基因和蛋白表達水平。
　　2.構(gòu)建了PTPN4過表達質(zhì)粒，并設計miR-183過表達和PTPN4過表達共轉(zhuǎn)染CD133+/CD326+A549CSLCs實驗，應用westernblot檢測了四組中PTPN4的蛋白表達水平;重復Transwell侵襲實驗檢測了四組中侵襲的細胞數(shù)。
　　3.結(jié)合臨床肺腺癌標本，應用qRT-PCR檢測組織標本中PTPN4基因的表達水平。
　　結(jié)果:
　　

8、1.miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的表達顯著升高
　　采用臨床用紫杉醇針劑(30mg/5 ml)，加藥濃度選定0.1μmol/L，加藥時間為48h;利用活細胞與細胞碎片的質(zhì)量差異采用rpm800轉(zhuǎn)進行離心，所得細胞克隆繼續(xù)無血清懸浮培養(yǎng)，經(jīng)過兩周時間，細胞的活性能夠恢復如初，在體外可以連續(xù)傳代培養(yǎng)，細胞大量成球生長，細胞膜圓潤完整，胞漿折光性好，隔天即可以傳代。流式熒光檢測技術(shù)可見富集的CD133+

9、/CD326+ A549 CSLCs比例在68％左右。
　　實時定量PCR技術(shù)檢測普通A549細胞和CD133+/CD326+ A549 CSLCs中miR-183的表達，發(fā)現(xiàn)CD133+/CD326+ A549 CSLCs中miR-183表達較普通A549細胞顯著升高。
　　2.miR-183促進CD133+/CD326+ A549 CSLCs侵襲和遷移。
　　為進一步研究miR-183在CD133+/CD326+

10、A549 CSLCS中的作用，我們成功構(gòu)建了miR-183慢病毒過表達和干擾載體pLenti6.3-miR-183和pLenti6.3-anti-miR-183，我們將其轉(zhuǎn)染CD133+/CD326+ A549 CSLCS，建立miR-183過表達和干擾的CD133+/CD326+ A549CSLCS，免疫熒光結(jié)果提示攜帶有GFP的慢病毒質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染進CD133+/CD326+ A549CSLCS;經(jīng)實時定量PCR檢測miR-183在轉(zhuǎn)

11、染慢病毒載體的CD133+/CD326+ A549 CSLCS中的表達，pLenti6.3-miR-183轉(zhuǎn)染組中miR-183較對照組顯著升高，而在pLenti6.3-anti-miR-183轉(zhuǎn)染組中miR-183較對照組顯著降低，這一結(jié)果進一步證明我們轉(zhuǎn)染成功。由此我們獲得了穩(wěn)定表達miR-183和anti-183的CD133+/CD326+ A549 CSLCS，這些細胞為我們隨后體內(nèi)、體外實驗研究miR-183在肺腺癌始動細胞中

12、的作用提供了細胞支撐。
　　結(jié)合課題組前期實驗數(shù)據(jù)，我們進行了裸鼠體內(nèi)成瘤實驗，經(jīng)裸鼠尾靜脈注射pLenti6.3-miR-183轉(zhuǎn)染的CD133+/CD326+ A549 CSLCS，28天后經(jīng)生物熒光技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)裸鼠肺部形成轉(zhuǎn)移瘤，且miR-183過表達組所形成的轉(zhuǎn)移瘤的熒光強度較對照組明顯增強;同時為排除CD133+/CD326+ A549 CSLCS增殖所帶來的影響，我們用CCK8對miR-183過表達組和對照組進行了檢測

13、，結(jié)果顯示兩組無明顯差異;我們還進行了體外Transwell實驗檢測了miR-183過表達或低表達的CD133/CD326雙陽性細胞的遷移和侵襲現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)miR-183過表達組較對照組產(chǎn)生遷移和侵襲的細胞數(shù)明顯增多，而miR-183低表達組則較對照組遷移及侵襲的細胞數(shù)明顯減少。體內(nèi)外結(jié)果均提示miR-183在CD133+/CD326+ A549 CSLCS中發(fā)揮促侵襲和遷移的作用，表明miR-183可作為致癌基因促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

14、r>　　3.miR-183通過負調(diào)控PTPN4促進CD133+/CD326+ A549 CSLCS侵襲作用
　　我們利用targetscan、picTar、miRanda等網(wǎng)絡miRNA靶基因預測系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)miR-183潛在的下游靶點包括有癌基因、抑癌基因、細胞信號轉(zhuǎn)導分子，細胞周期調(diào)控基因和與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子，例如EGR1，PTPN4，ZEB1，PTEN和PDCD4等。
　　我們利用雙熒光素酶基因報告載體系統(tǒng)將PTPN4

15、野生型和突變型的3'-UTR區(qū)重組到pGL3質(zhì)粒載體上，然后和miR-183共轉(zhuǎn)染293T細胞，通過熒光活性檢測，野生型組熒光強度顯著降低，而突變組無明顯變化。隨后我們又通過在基因水平和蛋白水平直接檢測經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染低表達miR-183的CD133+/CD326+ A549 CSLCS，PTPN4基因和蛋白表達水平較對照組明顯上升。間接實驗和直接實驗均驗證了PTPN4是miR-183下游靶點之一。
　　我們構(gòu)建了PTPN4過表達載體

16、，并設計了共轉(zhuǎn)染實驗，首先，我們應用western blot檢測了四組中PTPN4的蛋白表達水平，可見miR-control+PTPN4過表達組PTPN4較其他三組顯著上升，miR-183過表達+vector組較其他組明顯下降;其次我們利用上述四組細胞重復了Transwell侵襲實驗，細胞計數(shù)結(jié)果顯示miR-183過表達+vector組侵襲細胞數(shù)最多，與miR-control+vector組和miR-183過表達+PTPN4過表達組存在

17、明顯差異，而miR-control+PTPN4過表達組發(fā)生侵襲的細胞數(shù)最少，較miR-control+vector組有顯著差異;最后我們對臨床肺腺癌標本檢測了miR-183和PTPN4基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)無轉(zhuǎn)移標本的PTPN4基因表達較有轉(zhuǎn)移標本顯著降低;相關(guān)分析表明，在同一肺腺癌組織標本中miR-183表達水平與PTPN4mRNA表達水平呈顯著負相關(guān)。上述實驗結(jié)果提示，miR-183可以通過直接負調(diào)控下游靶基因PTPN4發(fā)揮促進CD1