CXCR4-CXCL12生物軸促進結腸癌細胞侵襲轉移作用的研究.pdf

1、研究目的：
　　結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別是第二位和第三位，嚴重威脅人類的健康。結腸癌患者死亡的主要原因是轉移和局部復發(fā)，為此人們對結腸癌轉移的機制進行了大量的研究。腫瘤細胞轉移的步驟主要包括，腫瘤細胞原發(fā)灶過度增殖及血管生成，分泌膠原酶降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和基底膜，細胞從原發(fā)部位分離脫落，浸潤血管或淋巴管并在

2、血流中形成癌栓隨血流遷移，腫瘤細胞遷移至靶器官通過增殖和血管生成形成新生灶。腫瘤細胞的轉移是一個十分復雜的動態(tài)的生物學過程，由多個相對獨立的步驟組成，每一個步驟涉及到多種分子事件。
　　目前對于腫瘤細胞侵襲轉移機制的解釋很多，其中腫瘤“歸巢”學說認為某些腫瘤細胞高表達趨化因子受體，而靶器官高表達趨化因子，腫瘤細胞可以像白細胞一樣在趨化因子的誘導下向靶器官遷移。CXCL12是一種細胞趨化因子，其受體為細胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體CXCR

3、4，CXCL12與CXCR4相互作用形成偶聯(lián)分子對，共同促進白細胞和造血干細胞的遷移。近年來研究發(fā)現(xiàn)，結腸癌組織中高表達CXCR4，而其最常見的轉移部位如淋巴，肝等則高表達其配體CXCL12，并且從肝組織中提取的物質(zhì)對CXCR4高表達的結腸癌細胞有很強的趨化作用。說明CXCR4/CXCL12可能參與了結腸癌侵襲轉移的過程，但是其具體機制還不清楚。本課題主要通過外實驗，研究CXCR4/CXCL12生物軸對人結腸癌細胞促襲轉移的作用，在進一

4、步確證CXCL12促腫瘤侵襲轉移活性的基礎上，探討其作用機制，為開發(fā)高效抗腫瘤侵襲轉移藥物提供理論基礎。
　　實驗方法:
　　首先用western blotting方法和實時定量PCR方法檢測LOVO、HT-29、HCT-116、SW620和SW480五種結腸癌細胞中CXCR4的表達情況。用Lipo2000脂質(zhì)體轉染siRNA沉默HT-29中CXCR4的表達，western blotting方法檢測干擾不同時間點CXCR4的

5、表達情況。CCK-8和平板克隆形成實驗檢測CXCL12對HT-29細胞增殖的影響，劃痕實驗檢測CXCL12對HT-29細胞遷移的影響，transwell小室檢測CXCL12對HT-29細胞侵襲的影響，western blotting方法檢測CXCL12對PI3K/AKT/mTOR，MEK/ERK及Wnt/β-catenin信號通路的影響。用NE-PER核膜分離提取試劑盒檢測CXCL12對HT-29細胞β-catenin核轉位的影響。

6、r>　　實驗結果:
　　在LOVO、HT-29、HCT-116、SW620和SW4805種結腸癌細胞中，HT-29細胞的CXCR4mRNA和蛋白水平均比其他細胞高，因此選取CXCR4表達較高的HT-29細胞來研究CXCR4/CXCL12生物軸的生物效應。siRNA干擾實驗顯示，CXCR4siRNA在干擾24、48、72 h時，CXCR4的表達分別降低了61.1％、74.8％和82.4％。平板克隆形成實驗顯示CXCL12能顯著促進C

7、XCR4高表達的HT-29細胞的克隆形成，CXCR4被沉默掉之后CXCL12便失去了其促增殖的效果;遷移實驗結果顯示CXCL12能顯著促進HT-29細胞的遷移;Transwell侵襲實驗顯示，40ng/mL的CXCL12能顯著促進HT-29細胞的侵襲。CXCR4被沉默掉之后CXCL12便失去了其促侵襲遷移的效果;明膠酶譜實驗結果顯示，CXCL12可促進HT-29細胞的MMP-9、MMP-2的表達。然而，CXCR4被沉默的HT-29細胞對

8、CXCL12的刺激沒有反應;在HT-29細胞中，CXCL12可快速引起AKT、mTOR、ERK的磷酸化，說明CXCR4/CXCL12生物軸能激活PI3K/AKT/mTOR和MEK/ERK信號通路;CXCL12孵育48 h后，HT-29細胞內(nèi)總β-catenin的表達量沒有發(fā)生變化，但細胞核內(nèi)的β-catenin提高了76.9％，CXCR4的沉默阻礙了CXCL12促進β-catenin核轉位的作用。CXCL12還可以促進β-catenin

9、下游蛋白CyclinD1、MMP-7和survivin的表達。
　　實驗結論:
　　CXCR4/CXCL12生物軸具有促結腸腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移的效果，主要是通過促進MMP-2，MMP-9的分泌和PI3K/AKT/mTOR、MEK/ERK及Wnt/β-catenin信號通路起到促侵襲轉移的作用。提示CXCR4/CXCL12生物軸可以作為一種潛在的抗侵襲轉移藥物靶點，針對CXCR4/CXCL12軸的療法可能會成為治療結腸癌