羥基膽固醇在肺腺癌遷移和侵襲中的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥致死的主要原因。肺腺癌(ADC)是肺癌的主要常見亞型。其中轉(zhuǎn)移和侵襲是肺腺癌治療中的巨大挑戰(zhàn)。然而，基于轉(zhuǎn)移和侵襲的分子機制是非常復雜的并且涉及多種分子和通路。肝X受體(LXRα/NR1H3和LXRβ/NR1H2)是一種核受體，它的作用是作為配體-激活的轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)脂代謝和炎癥。LXR可以被天然配體羥基膽固醇類物質(zhì)（如25羥基膽固醇和27羥基膽固醇）激活，也可以被合成的激活劑激活如T09

2、01317(半數(shù)效應濃度為50nM)。25羥基膽固醇（25-HC）和27羥基膽固醇(27-HC)是兩種羥基膽固醇類物質(zhì)，是在多種組織器官中由膽固醇羥化酶催化而來的LXR配體。25-HC是一種有效的LXR介導的通路調(diào)節(jié)劑，參與體內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、炎癥和免疫反應。此外，25-HC還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如抑制膠質(zhì)母細胞瘤、乳腺癌、前列腺癌和前列腺癌異種移植物的細胞增殖。有研究表明，人體內(nèi)基礎(chǔ)水平的27-HC即能表現(xiàn)出顯著的ER和LXR部分激動劑活

3、性。除此之外，27-HC能夠通過激活受體明顯促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移，但是在黑色素瘤中，LXR的激活能抑制其轉(zhuǎn)移。
　　本實驗旨在研究25-HC和27-HC是否影響肺腺癌細胞的遷移和侵襲，并探索其機制，為臨床肺腺癌治療提供新的依據(jù)。
　　研究方法：
　　實驗本研究中，我們使用人肺腺癌細胞系A(chǔ)549或NCL-H1975（上室）和人單核細胞THP1細胞（下室）創(chuàng)立了單培養(yǎng)和共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測羥基膽固醇對肺腺癌細胞遷移和侵襲的影響。為了

4、排除羥基膽固醇對細胞增殖的影響，首先通過細胞增殖實驗實驗來評估羥基膽羥基膽固醇對細胞增殖的影響，為遷移和侵襲實驗選擇合適的濃度。實驗我們選擇了0.1μM的25-HC、1μM的27-HC和50nM的T0901317用于接下來的實驗。對于遷移實驗，將ADC細胞種在6孔板中培養(yǎng)過夜，隨后用無菌的200μL槍頭在單層細胞上劃出一條約lmm寬的線性劃痕區(qū)。在單培養(yǎng)組中，分別向培養(yǎng)系統(tǒng)中加入上述各種藥物;在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，加入的上清來自已經(jīng)用藥物作用

5、24小時的THP1分化的巨噬細胞。分別與0小時和24小時在相應位置拍照。對于侵襲實驗，懸于無血清培養(yǎng)基中的ADC細胞加入上室，含有上述藥物的完全培養(yǎng)基加入下室。根據(jù)說明書使用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELI SA)檢測從單培養(yǎng)和共培養(yǎng)系統(tǒng)中收集的上清液細胞因子（IL-1β和TGF-β1）含量。最后，使用免疫印跡（Western blotting）分析檢測蛋白LXR和Snail的表達量。
　　結(jié)果：
　　1.在0.1μM濃度時，25-

6、HC對細胞增殖沒有影響，但是從濃度1μM到25μM，25-HC能抑制兩種肺腺癌細胞的增殖，并且成劑量依賴性。對于27-HC，在0.1μM和1μM濃度時沒有影響，但在10μM到50μM濃度時有促進作用。T0901317對于這兩種肺腺癌細胞增殖均沒有影響。
　　2.在單培養(yǎng)系統(tǒng)中，羥基膽固醇（0.1μM的25-HC;1μM的27-HC）能夠促進肺腺癌細胞遷移和侵襲過程。在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，兩種肺腺癌細胞的劃痕愈合過程都顯著加速。此外，LX

7、R的激動劑T0901317與羥基膽固醇有相同的效應。
　　3.ELISA結(jié)果顯示，THP1分化的巨噬細胞在加入羥基膽固醇后減少了IL-lβ和TGF-β1的分泌。有趣的是，在巨噬細胞和ADC細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，IL-1β的基礎(chǔ)分泌量增加，加入羥基膽固醇后，對IL-1β釋放產(chǎn)生促進作用。這與單培養(yǎng)組的趨勢完全不同。
　　3.加入羥基膽固醇后，單培養(yǎng)系統(tǒng)中的LXR和Snail表達量增加，此過程在共培養(yǎng)系統(tǒng)中更加明顯。
　　4.

8、1L-1β能促進兩種ADC細胞的遷移和侵襲，還能上調(diào)蛋白Snail的表達，但對LXR沒有影響。
　　5.敲除LXR之后顯著抑制兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中25HC介導的Snail表達，但對IL-1β介導的Snail表達沒有作用。
　　6.敲除LXR后阻斷了25HC引起的ADC細胞遷移和侵襲，但不影響IL-1β誘導的ADC細胞的遷移和侵襲。
　　結(jié)論：
　　在這次研究中，我們發(fā)現(xiàn)25-HC在0.1μM濃度時不影響肺腺癌細胞增殖;

9、隨著濃度升高，25HC抑制細胞增殖。除此之外，25HC還能夠在不影響細胞增殖的情況下促進肺腺癌細胞的遷移和侵襲，尤其是在和THP-1分化的巨噬細胞共培養(yǎng)體系中表現(xiàn)更加明顯。與此同時，25HC的受體LXR的表達量也相應提高。在敲除LXR之后，25HC對ADC細胞的遷移和侵襲不再產(chǎn)生促進效應，且Snail的表達量也不再升高。以此可得出結(jié)論:25HC可以通過激活LXR的方式促進肺腺癌轉(zhuǎn)移。我們還發(fā)現(xiàn)，25HC都能夠在共培養(yǎng)系統(tǒng)中顯著地刺激IL

10、-1β的分泌，并能增加腫瘤轉(zhuǎn)移標志性蛋白Snail的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β模擬了25HC對ADC細胞遷移和侵襲以及Snail蛋白表達的促進作用，敲除LXR后，25HC的這種促進效應被阻斷，但IL-1β的促進作用沒有受到影響，我們的這些研究結(jié)果表明，25-HC在單一培養(yǎng)中是依賴LXR促進ADC細胞遷移和侵襲的，共培養(yǎng)體系中25-HC誘導的IL-1β分泌能以不依賴LXR的方式加速ADC細胞遷移和侵襲。
　　27HC的作用結(jié)果