PHIi-7體外抑制腫瘤侵襲遷移作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 PHⅡ-7體外抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移作用及機(jī)制研究
　　背景:腫瘤侵襲遷移是惡性腫瘤的主要特征之一，也是導(dǎo)致腫瘤治療失敗、腫瘤復(fù)發(fā)和病人死亡的主要原因之一，但是目前針對(duì)腫瘤侵襲遷移仍無(wú)有效的治療方法。中藥當(dāng)歸龍薈丸用于治療慢性粒細(xì)胞性白血病有較好的療效，其活性成分靛玉紅有顯著的抗腫瘤活性。本室以靛玉紅的分子結(jié)構(gòu)為模板，設(shè)計(jì)、合成并篩選出一種有較高抗腫瘤活性、較低毒性的衍生物，將其命名為PHⅡ-7。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，PHⅡ

2、-7呈現(xiàn)良好的廣譜抗腫瘤活性，對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株k562和k562/A02（k562多藥耐藥細(xì)胞株），人急性早幼粒細(xì)胞株HL60和HL60/ADR(HL60多藥耐藥細(xì)胞株)，人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MCF-7/ADR（MCF-7多藥耐藥細(xì)胞株）等有明顯細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。本文主要探究PHⅡ-7體外對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的作用及其作用機(jī)制。
　　方法:本文以3株高侵襲遷移細(xì)胞株MDA-MB-231（人乳腺癌細(xì)胞株），MCF-7/

3、ADR（人乳腺癌MCF-7多藥耐藥細(xì)胞株）和A549（人肺腺癌細(xì)胞株）作為研究對(duì)象，對(duì)PHⅡ-7體外抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移作用及作用機(jī)制進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)方法如下:通過(guò)MTT法對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測(cè);通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)速率;通過(guò)細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞克隆形成能力和增殖能力;通過(guò)transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移能力;通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死情況;通過(guò)realtimePCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因mRNA水平表達(dá);通過(guò)免疫印

4、跡實(shí)驗(yàn)(western blot)檢測(cè)基因蛋白水平表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用SPSS13.0軟件和Graphpad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:首先，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCF-7/ADR細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞相比有較強(qiáng)的侵襲性和遷移性，其上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(EMT)特征明顯，EMT標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)明顯降低，而Slug，β-catenin和vimentin表達(dá)明顯增強(qiáng)。其次，PHⅡ-7在低濃度條件下能有效地抑制腫瘤細(xì)胞侵

5、襲和遷移，且呈明顯的濃度依賴性。PHⅡ-7在高濃度條件下能有效地抑制細(xì)胞增殖和集落形成，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。PHⅡ-7能誘導(dǎo)高侵襲遷移性細(xì)胞凋亡，主要是通過(guò)激活凋亡相關(guān)經(jīng)典信號(hào)通路caspase家族實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PHⅡ-7抑制侵襲遷移作用機(jī)制與EMT過(guò)程有關(guān)，PHⅡ-7作用侵襲遷移性腫瘤細(xì)胞能有效增強(qiáng)其上皮細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，降低間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，其中包括EMT標(biāo)記基因E-cadherin，Slug，β-c

6、atenin和vimentin，表明PHⅡ-7抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移主要通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
　　結(jié)論:藥物治療一直是臨床常用的腫瘤治療手段，但其毒副作用較大。目前急需加快抗腫瘤藥物研發(fā)，完善臨床治療策略。PHⅡ-7是一種有研究?jī)r(jià)值的抗腫瘤衍生物，PHⅡ-7不僅能增強(qiáng)耐藥腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移，體內(nèi)外對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)也有顯著的抑制作用。對(duì)PHⅡ-7抗腫瘤作用機(jī)制的研究為研發(fā)低毒高效的抗腫瘤藥物、臨床輔

7、助治療藥物和分子靶向藥物提供重要數(shù)據(jù)。
　　第二部分 PHⅡ-7體外抗腫瘤作用機(jī)制研究
　　背景:近年來(lái)抗腫瘤藥物發(fā)展迅速，尤其是針對(duì)有效靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物。PHⅡ-7是以傳統(tǒng)中藥當(dāng)歸龍薈丸的活性成分靛玉紅為模板設(shè)計(jì)、合成的抗腫瘤衍生物。PHⅡ-7體外有良好的廣譜抗腫瘤活性，能明顯抑制多種腫瘤細(xì)胞和耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)，但PHⅡ-7具體作用機(jī)制仍不明確。實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)PHⅡ-7的抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，利用化學(xué)修飾和蛋白組學(xué)方法研

8、究發(fā)現(xiàn)，PHⅡ-7氨烷基側(cè)鏈衍生物體外可以與k562細(xì)胞裂解物中的α-烯醇化酶(ENO1)結(jié)合。為進(jìn)一步探究PHⅡ-7與其特異性結(jié)合的靶蛋白ENO1的關(guān)系，前期構(gòu)建和篩選了穩(wěn)定干擾ENO1的k562細(xì)胞系k562-shENO1及其對(duì)照細(xì)胞系k562-shCON，本文對(duì)穩(wěn)定干擾ENO1細(xì)胞株進(jìn)行了鑒定，旨在探究PHⅡ-7作用機(jī)制及干擾ENO1后對(duì)PHⅡ-7作用的影響。
　　方法:本文以2株穩(wěn)定干擾細(xì)胞株k562-shCON和k562

9、-shENO1作為研究對(duì)象，對(duì)PHⅡ-7體外作用機(jī)制進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)方法如下:通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);通過(guò)MTT法對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測(cè);通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死情況;通過(guò)甲基纖維素半固體集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力;通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞群中干細(xì)胞比例;通過(guò)realtimePCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因mRNA水平表達(dá);通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot)檢測(cè)基因蛋白水平表達(dá);通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)腫瘤

10、形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和干性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用SPSS13.0軟件和Graphpad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:穩(wěn)定干擾細(xì)胞株k562-shCON和k562-shENO1與k562細(xì)胞相比，形態(tài)無(wú)明顯改變，細(xì)胞生長(zhǎng)為正常懸浮狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定干擾ENO1后，k562細(xì)胞對(duì)PHⅡ-7抑制細(xì)胞增殖作用更為敏感。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定干擾細(xì)胞株k562-shCON和k562-shENO1生長(zhǎng)速率無(wú)明顯差異，但k562-

11、shENO1對(duì)低濃度PHⅡ-7抑制生長(zhǎng)作用更敏感。PHⅡ-7能誘導(dǎo)k562-shCON細(xì)胞和k562-shENO1細(xì)胞凋亡，主要通過(guò)激活凋亡相關(guān)經(jīng)典信號(hào)途徑caspase家族實(shí)現(xiàn)。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PHⅡ-7能誘導(dǎo)k562-shCON細(xì)胞核和k562-shENO1細(xì)胞核裂解，且k562-shENO1細(xì)胞核裂解更明顯。動(dòng)物體內(nèi)腫瘤形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，k562-shCON實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤全部形成，且瘤體積較大;k562-shENO1實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤

12、形成比例較小，且瘤體積較小。
　　結(jié)論:通過(guò)化學(xué)修飾和蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法發(fā)現(xiàn)，PHⅡ-7體外能與ENO1結(jié)合。通過(guò)進(jìn)一步體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在k562細(xì)胞內(nèi)干擾ENO1表達(dá)，能顯著增強(qiáng)PHⅡ-7對(duì)細(xì)胞的殺傷作用，表明PHⅡ-7在細(xì)胞內(nèi)的作用可能首先是通過(guò)抑制或影響ENO1功能實(shí)現(xiàn)，但PHⅡ-7作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)還需進(jìn)一步研究。對(duì)PHⅡ-7作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)的研究，將為新型抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)和研發(fā)提供重要的數(shù)據(jù)，并有利于對(duì)傳統(tǒng)抗腫瘤藥物

13、當(dāng)歸龍薈丸的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用。
　　第三部分穩(wěn)定干擾α-烯醇化酶對(duì)k562/A02細(xì)胞生長(zhǎng)及耐藥性的影響
　　背景:藥物治療是臨床腫瘤治療常用方法之一，目前部分抗腫瘤藥物會(huì)產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，如乳腺癌常用抗腫瘤藥物他莫昔芬。腫瘤耐藥的產(chǎn)生是腫瘤治療失敗的主要原因之一，也是腫瘤臨床治療的難題。研究表明，α烯醇化酶(ENO1)與腫瘤細(xì)胞耐藥產(chǎn)生和發(fā)展密切相關(guān)，耐藥腫瘤細(xì)胞中ENO1常呈異常表達(dá)狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究ENO1在人慢性粒

14、細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株k562/A02中的作用。
　　方法:通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，將pSilencer U6-shCON質(zhì)粒和pSilencer U6-shENO1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入k562/A02細(xì)胞中，利用篩選標(biāo)記潮霉素進(jìn)行篩選和單克隆細(xì)胞培養(yǎng)，構(gòu)建穩(wěn)定干擾ENO1的k562/A02-shENO1細(xì)胞株和對(duì)照k562/A02-shCON細(xì)胞株;通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);通過(guò)MTT法對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測(cè);通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;通過(guò)

15、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死情況;通過(guò)甲基纖維素半固體集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力;通過(guò)realtime PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因mRNA水平表達(dá);通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot)檢測(cè)基因蛋白水平表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用SPSS13.0軟件和Graphpad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:與敏感性細(xì)胞株k562相比，ENO1在耐藥細(xì)胞株k562/A02表達(dá)增高，其在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)分別增高(2.85±

16、0.56)倍和(1.43±0.05)倍。k562/A02細(xì)胞生長(zhǎng)速率與k562細(xì)胞相比無(wú)顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)成功篩選3株穩(wěn)定干擾ENO1的細(xì)胞株k562/A02-shENO1和對(duì)照細(xì)胞系k562/A02-shCON。3株k562/A02-shENO1細(xì)胞與對(duì)照組k562/A02-shCON細(xì)胞相比生長(zhǎng)速率均降低，對(duì)抗腫瘤藥物紫杉醇和阿霉素的敏感性均增強(qiáng)。k562/A02-shENO1細(xì)胞對(duì)羅丹明123蓄積能力與對(duì)照組相比顯著性增強(qiáng)，同時(shí)k

17、562/A02-shENO1細(xì)胞中耐藥相關(guān)基因MDR1表達(dá)水平在mRNA水平和蛋白水平均降低。甲基纖維素半固體集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，k562/A02-shENO1細(xì)胞中細(xì)胞克隆能力明顯降低。
　　結(jié)論:穩(wěn)定干擾ENO1表達(dá)不僅能抑制k562/A02細(xì)胞生長(zhǎng)和降低細(xì)胞群中干細(xì)胞比例，還能增強(qiáng)k562/A02細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物敏感性，降低其MDR1基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明，ENO1與k562/A02細(xì)胞耐藥基因表達(dá)相關(guān)，ENO1可以作為k562/