葉酸殼聚糖川芎嗪納米粒體外抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移作用研究.pdf

1、目的:
　　探討葉酸殼聚糖川芎嗪納米粒體外抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用及其機制。
　　方法:
　　1.葉酸殼聚糖川芎嗪納米粒（主動靶向納米粒，F(xiàn)A-CS-LZ-NPs）的制備。采用離子交聯(lián)法制備葉酸殼聚糖川芎嗪納米粒，對其進行質(zhì)量評價。包封率、載藥量檢測采用高效液相色譜法，用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)并采用激光粒度分析儀進行粒徑檢測。
　　2.MTT法檢測FA-CS-LZ-NPs的細胞毒性，確定給藥劑量。取對數(shù)生長期人宮頸

2、癌Hela細胞和人肺腺癌A549細胞，將不同給藥濃度(2、1、0.5、0.25、0.05、0.025、0.01mg·mL-1)的FA-CS-LZ-NPs和空納米粒分別作用于以上兩種細胞。計算7個給藥濃度下細胞存活率，設(shè)定細胞存活率為95％的藥物濃度為給藥劑量。
　　3.實驗分組與給藥方案
　　實驗組:給予主動靶向納米粒;
　　對照組:分別給予殼聚糖川芎嗪納米粒（被動靶向納米粒，CS-LZ-NPs）、川芎嗪溶液(ligu

3、strazine，LZ)、空納米粒;
　　空白對照組:僅給予空白培養(yǎng)基。
　　4.抑制腫瘤細胞侵襲作用研究:采用Tanswell小室侵襲實驗觀察主動靶向納米粒抑制腫瘤細胞侵襲作用。每個小室（預(yù)鋪Matrigel膠）上方分別加入含牛血清白蛋白(BSA)，不含胎牛血清(FBS)的Hela和A549細胞混懸液，小室下方加入含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液，按3項下方法進行分組給藥。作用24 h后，移出小室，用棉簽擦去小室上方細胞，多聚甲醛

4、固定，結(jié)晶紫染色，PBS沖洗，顯微鏡拍照(200×)，比較各組侵襲細胞數(shù)量。
　　5.MMP-9與VEGF蛋白表達檢測:采用western blot法檢測MMP-9與VEGF蛋白表達情況。取對數(shù)生長期Hela和A549細胞進行分組給藥，實驗組給予主動靶向納米粒，對照組分別給予被動靶向納米粒和川芎嗪溶液，空白對照組僅給予空白培養(yǎng)基，24h后，進行各給藥組細胞的總蛋白提取，經(jīng)過電泳分離，轉(zhuǎn)膜和抗體孵育等步驟后進行用脫脂奶粉封閉，發(fā)光試

5、劑顯影，置于暗匣顯影于膠片，定影，拍照，灰度分析軟件檢測細胞中MMP-9和VEGF蛋白表達情況，并以β-actin為內(nèi)參，計算MMP-9與VEGF蛋白表達水平。
　　6.MMP-9與VEGF基因表達檢測:采用Realtime-PCR法檢測MMP-9與VEGF基因表達情況。選取對數(shù)生長期Hela和A549細胞進行分組給藥，實驗組給予主動靶向納米粒，對照組分別給予被動靶向納米粒和川芎嗪溶液，空白對照組僅給予空白培養(yǎng)基，給藥24 h后，

6、各給藥組進行總RNA的提取，加入引物后反轉(zhuǎn)錄目標(biāo)RNA，采用實時定量PCR法計算MMP-9與VEGF基因表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.FA-CS-LZ-NPs的制備
　　制備的FA-CS-LZ-NPs粒徑為133.9±4.1nm，包封率為38.61±0.79％，載藥量為9.65±0.20％，分散度(PDI)為0.249±0.0030，納米粒分散性好，成圓球形。
　　2.FA-CS-LZ-NPs細胞毒性
　

7、　FA-CS-LZ-NPs對Hela細胞的無毒劑量為相當(dāng)于川芎嗪濃度42.40μg·mL-1，該濃度下A549細胞的生長率為97.13％。空白納米粒在給藥濃度范圍內(nèi)對2種細胞無細胞毒性。
　　3.抑制腫瘤細胞侵襲
　　Transwell侵襲實驗顯示，主、被動靶向納米粒和溶液組均能顯著抑制Hela細胞和A549細胞的侵襲作用。然而，對于葉酸受體高表達的Hela細胞，主動納米粒組遷移的細胞數(shù)顯著低于被動靶向納米粒組和溶液組，具有

8、顯著性差異，而對A549細胞則不存在顯著性差異。
　　4.對MMP-9和VEGF蛋白表達的影響。
　　Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組比較，主、被動靶向納米粒和溶液組均能顯著抑制Hela細胞和A549細胞MMP-9酶的表達，對于葉酸受體高表達的Hela細胞，主動靶向納米粒組MMP-9酶的表達顯著低于被動靶向納米粒組和溶液組，其具有顯著性差異，而A549細胞則不存在顯著性差異。對VEGF蛋白的檢測結(jié)果顯示，與空白

9、對照組比較，主、被動靶向納米粒和溶液組均能顯著抑制Hela細胞和A549細胞VEGF蛋白的表達，對于葉酸受體高表達的Hela細胞，主動靶向納米粒組VEGF蛋白的表達顯著低于溶液組，但與被動靶向納米粒組比較，差異無顯著性。A549細胞經(jīng)各給藥組處理后，主、被動靶向納米粒和溶液組均能顯著抑制其VEGF蛋白的表達，與空白對照組比較具有顯著性差異，主動靶向納米粒組VEGF蛋白的表達顯著低于溶液組，但與被動靶向納米粒組比較，差異無顯著性。

10、　　5.對MMP-9和VEGF基因表達的影響。
　　Realtime-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組比較，主、被動靶向納米粒和溶液組均能顯著抑制Hela細胞和A549細胞MMP-9和VEGF基因的表達，并且，對于葉酸受體高表達的Hela細胞，主動靶向納米粒組與被動靶向納米粒組和溶液組比較均存在顯著性差異，而A549細胞主、被動組之間不存在顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　與各對照組相比，F(xiàn)A-CS-LZ-NPs具有明顯抑制H