COX-2介導川芎嗪抑制肺癌A549細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用研究.pdf

1、1.背景：
　　 肺癌患者的死亡率處于各種惡性腫瘤的首位，侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌治療失敗的重要原因之一。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多環(huán)節(jié)、多步驟的復(fù)雜過程，涉及的細胞因子及分子機制為腫瘤的防治提供了靶點。環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)就是其中非常重要一條途徑。
　　 COX是分解花生四烯酸(arachidonic acid，AA)生成各種內(nèi)源性前列腺素（Prostaglandins，PGs）過程中關(guān)鍵的限速酶。1

2、991年研究證實有兩種COX存在，即結(jié)構(gòu)型COX-1和誘生型COX-2。COX-1被認為是“看家”基因，幾乎在所有正常組織中結(jié)構(gòu)性表達，介導維持生理性自身穩(wěn)定的前列腺素合成，因而具有保護胃表面上皮細胞，擴張腎血管等功能。COX-2為可誘生型COX，正常生理狀態(tài)下多數(shù)組織內(nèi)檢測不到。當細胞受到炎癥信號、某些細胞因子等刺激后表達增加。研究證實，COX-2的表達在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中明顯增高，COX-2表達陽性組腫瘤有更強的侵襲性，患者生

3、存期縮短，提示COX-2與腫瘤的生長、侵襲轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后密切相關(guān)。COX-2表達強度以非小細胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)中的腺癌最高，呈中強而廣泛的表達，其次為鱗癌，小細胞肺癌中只有很少個別病例能檢測到中等水平的表達。COX-2在正常支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞未見表達或弱表達。COX-2可通過多種致癌機制參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，有研究提出，雖然腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多步驟的復(fù)雜過程，

4、但COX-2，很可能是這一過程的一個中心調(diào)控因素。
　　 目前對COX-2有抑制作用的藥物主要是非甾體類抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)，包括COX非選擇性抑制劑和COX-2選擇性抑制劑。COX非選擇性抑制劑因同時抑制了COX-1而存在不容忽視的消化道副作用如消化道潰瘍甚至出血;COX-2選擇性抑制劑的胃腸道副作用減輕，但COX-2選擇性抑制劑的腎毒性和引起心血管

5、不良事件發(fā)生率增高的副作用同樣不容忽視，使COX-2選擇性抑制劑在腫瘤防治中長期應(yīng)用的安全性受到質(zhì)疑。更為安全有效的COX-2抑制劑有待進一步研究和發(fā)現(xiàn)。
　　 川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)，是從中藥川芎中分離提純出來的一種生物堿，其化學結(jié)構(gòu)明確，為四甲基吡嗪，我們熟知的藥理作用包括阻滯平滑肌的鈣通道、抑制血小板聚集及激活等，目前臨床主要應(yīng)用于缺血性心、腦血管疾病的治療。在中國，中醫(yī)活血化淤法及其方藥

6、治療腫瘤有悠久的歷史和確切的療效，而川芎嗪作為活血化淤類中藥川芎的提取物，關(guān)于其在腫瘤防治中的研究報導，自上個世紀八十年代以來陸續(xù)出現(xiàn)并日益受到人們的關(guān)注。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可調(diào)節(jié)肺癌患者的Th1/Th2平衡而發(fā)揮抗腫瘤的免疫治療作用。研究顯示川芎嗪還可通過誘導腫瘤細胞的凋亡，改善荷瘤機體的高凝狀態(tài)等方面，抑制肺癌的生長和侵襲轉(zhuǎn)移，在腫瘤的預(yù)防和治療中，顯示出重要的應(yīng)用價值和良好的應(yīng)用前景。但也有研究報導，川芎嗪可在不同程度上

7、增加肺癌細胞的粘附。而且，目前關(guān)于川芎嗪在肺癌防治中的作用，主要局限于動物實驗或細胞行為的觀察，對于其作用的細胞分子機制知之甚少，對于細胞因子、基因調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導通路等方面的研究，還有待進一步深入。
　　 2004年，萬敬員等研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可顯著減少脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激的小鼠心肌巨噬細胞COX-2mRNA和蛋白表達，從而拮抗LPS誘導的乳鼠心肌細胞凋亡，但對COX-2活性無明顯作用。2008

8、年，張凌等研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可明顯減少急性肺血栓栓塞癥大鼠COX-2的表達，從而減輕炎癥反應(yīng)。但是自發(fā)現(xiàn)COX-2以來，關(guān)于川芎嗪對肺癌中COX-2的作用及其意義尚未有報導。鑒于此，我們設(shè)想以COX-2為切入點，對川芎嗪在肺癌特別是肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其細胞分子機制進行探討。根據(jù)COX-2在肺癌中的表達特性，我們選用了COX-2表達較高的人肺腺癌A549細胞進行研究。選取COX非特異性抑制劑吲哚美辛(indomethacin，IN)為陽性

9、對照藥物。
　　 因為目前關(guān)于川芎嗪對A549細胞作用的相關(guān)研究甚少，因此我們首先觀察了不同濃度川芎嗪對A549細胞增殖活性的影響，并對其機制進行了初步探討，主要目的在于篩選下一步實驗所選用的川芎嗪實驗濃度和觀察時間點。第二部分，我們利用Transwell細胞侵襲實驗以及建立腫瘤肺轉(zhuǎn)移的動物模型，通過體外和體內(nèi)實驗觀察川芎嗪對A549細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。第三部分，我們分別從酶活性、蛋白表達、催化產(chǎn)物和組織水平檢測了上述過程

10、中川芎嗪對A549細胞COX-2的影響，對COX-2在川芎嗪抑制肺癌A549細胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用進行探討。
　　 2.研究內(nèi)容
　　 第一部分川芎嗪對人肺癌A549細胞增殖的作用及機制研究
　　 目的：
　　 (1)觀察川芎嗪對A549細胞增殖活性的影響，并對其機制進行初步探討;
　　 (2)篩選下一步實驗選用的川芎嗪濃度和作用時間點。
　　 方法：
　　 研究選用藥物為鹽酸川芎嗪

11、注射液，(北京市永康藥業(yè)有限公司，40mg/2ml)。鹽酸川芎嗪注射液是目前臨床和實驗室研究川芎嗪常用的藥物劑型，也便于保證細胞實驗和動物實驗所用研究藥物的一致性。
　　 (1)MTT方法檢測川芎嗪對A549細胞增殖活性的作用:100～1000μg/ml共十個川芎嗪濃度組，分別與A549細胞培養(yǎng)24，48和72小時，MTT方法檢測各組細胞相對存活率。
　　 (2)流式細胞術(shù)檢測川芎嗪對A549細胞的細胞周期影響:A549

12、細胞與200μg/ml川芎嗪（TMP200組），400μg/ml川芎嗪（TMP400組），800μg/ml川芎嗪（TMP800組），以及陽性對照200μM吲哚美辛（IN組）分別培養(yǎng)24、48和72小時，收集細胞，流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期的百分比。
　　 (3)Wersternblot方法檢測川芎嗪對A549細胞中ERK1/2蛋白表達的影響:A549細胞與200μg/ml川芎嗪（TMP200組），400μg/ml川芎嗪(TMP4

13、00組)，800μg/ml川芎嗪（TMP800組），以及陽性對照200μM吲哚美辛（IN組）分別培養(yǎng)24、48和72小時，收集細胞提取蛋白，Wersternblot方法檢測各組p-ERK1/2和總ERK1/2蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 (1)川芎嗪可抑制A549細胞的增殖活性，其作用呈時間和劑量依賴性。根據(jù)結(jié)果，選取200，400和800μg/ml川芎嗪進行下一步的實驗;選取對A549細胞增殖活性沒有明顯影響的20

14、0μg/ml川芎嗪進行細胞侵襲實驗。
　　 (2)川芎嗪培養(yǎng)組G0-G1期的細胞比率較對照組明顯增多，使相應(yīng)S期細胞比率減少。川芎嗪對A549細胞周期的阻滯作用呈劑量依賴性。
　　 (3)川芎嗪可抑制A549細胞中p-ERK1/2的蛋白表達，其作用呈時間和劑量依賴性。
　　 結(jié)論：
　　 (1)川芎嗪可抑制A549細胞的增殖，其作用呈時間和劑量依賴性。
　　 (2)川芎嗪可通過阻滯A549細胞于細

15、胞周期的G0-G1期而抑制其增殖。
　　 (3)ERK是川芎嗪抑制A549細胞增殖的機制之一。
　　 第二部分:川芎嗪對人肺癌A549細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用研究
　　 目的:
　　 (1)體外細胞實驗觀察川芎嗪對A549細胞侵襲力的影響;
　　 (2)體內(nèi)動物實驗觀察川芎嗪對A549細胞遠處肺轉(zhuǎn)移的影響。
　　 方法:
　　 (1)Transwell侵襲實驗檢測川芎嗪對A549細胞侵襲

16、能力的影響:在底部鋪有Matrigel的Transwell小室中，A549細胞和200μg/ml川芎嗪組培養(yǎng)24小時，穿越至Transwell小室底部的細胞固定、染色、計數(shù)，和對照組比較統(tǒng)計細胞數(shù)的變化。
　　 (2)ELISA方法檢測川芎嗪對A549細胞MMP-2/TIMP-2分泌水平的影響:A549細胞分別和200μg/ml川芎嗪(TMP200)，400μg/ml川芎嗪（TMP400），800μg/ml川芎嗪(TMP800)

17、，陽性對照200μM吲哚美辛（IN）以及空白對照培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24小時，收集各組的培養(yǎng)上清液，ELISA方法檢測各組MMP-2/TIMP-2的濃度。
　　 (3)利用BALB/c裸鼠，通過尾靜脈注射法建立A549細胞肺轉(zhuǎn)移的動物模型。觀察A549細胞在肺內(nèi)轉(zhuǎn)移過程，確定實驗觀察時間點。實驗組給予腹腔注射川芎嗪100mg/kg/day，對照組給予等劑量生理鹽水，每天觀察裸鼠的毛發(fā)、飲食和精神狀態(tài)，每4天稱重，28天后殺死裸鼠取肺，

18、計數(shù)裸鼠肺表面轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目;H&E染色，組織學檢測肺內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的情況。
　　 結(jié)果:
　　 (1)川芎嗪對A549細胞侵襲力的影響:A549細胞與200μg/ml川芎嗪共培養(yǎng)24小時后，穿越過Transwell小室基底膜的細胞數(shù)與對照組相比明顯減少，表明川芎嗪對A549細胞的侵襲力具有明顯的抑制作用。
　　 (2)川芎嗪對A549細胞分泌MMP-2/TIMP-2的作用:培養(yǎng)24小時后，TMP200，TMP400和T

19、MP800組MMP-2/TIMP-2的水平較對照組均有顯著意義的降低，表明川芎嗪對A549細胞分泌MMP-2/TIMP-2具有抑制作用。抑制作用隨川芎嗪劑量的增加而增強。
　　 (3)川芎嗪對A549細胞遠處肺轉(zhuǎn)移的作用:通過尾靜脈注射法可成功建立裸鼠肺轉(zhuǎn)移的動物模型。通過觀察A549細胞在肺內(nèi)轉(zhuǎn)移過程，選用經(jīng)尾靜脈注射A549細胞后第29天作為獲取裸鼠肺組織的時間點。川芎嗪治療組A549細胞肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目和大小較對照組均明顯減

20、少。除了可很快緩解的局部刺激癥狀，川芎嗪治療組裸鼠的精神狀態(tài)和體重較對照組無明顯差別。
　　 結(jié)論:
　　 (1)川芎嗪對人肺癌A549細胞的侵襲力具有明顯的抑制作用。
　　 (2)川芎嗪能夠抑制A549細胞的體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移，并表現(xiàn)出較低的毒副作用和較好的安全性。
　　 (3)首次提示MMP-2/TIMP-2可能是川芎嗪抑制A549細胞侵襲的作用機制之一。
　　 第三部分:川芎嗪對人肺癌A549細胞C

21、OX-2的作用研究
　　 目的:
　　 分別從酶活性、蛋白表達、代謝產(chǎn)物和組織水平，觀察川芎嗪抑制肺癌A549細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中COX-2的變化，探討COX-2在川芎嗪抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 方法:
　　 (1)COX-2酶活性的檢測:A549細胞分別和200μg/ml川芎嗪(TMP200)，400μg/ml川芎嗪(TMP400)，800μg/ml川芎嗪(TMP800)，陽性對照200μM吲哚美

22、辛(IN)以及空白對照培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24小時，收集細胞，超聲破碎細胞，提取上清液，采用COX酶活性熒光檢測試劑盒測定各組酶活性。
　　 (2)Westernblot方法檢測A549細胞中COX-2的蛋白表達:上述各組細胞分別培養(yǎng)24小時，收集細胞，提取蛋白，采用Westernblot方法檢測各組A549細胞中COX-2的蛋白表達。
　　 (3)放射性免疫測定A549細胞培養(yǎng)上清液中PGE2的濃度:上述各組細胞分別培養(yǎng)24

23、小時，收集上清液，放射性免疫法測定各組PGE2的濃度。
　　 (4)免疫組化方法檢測A549細胞肺轉(zhuǎn)移瘤組織中COX-2的表達。
　　 結(jié)果:
　　 (1)川芎嗪對A549細胞COX-2酶活性的影響:A549細胞經(jīng)川芎嗪培養(yǎng)24小時后，與吲哚美辛組一樣，TMP200，TMP400和TMP800組COX-2的酶活性較對照組均明顯下降，但各川芎嗪組間未表現(xiàn)出明顯差異。
　　 (2)川芎嗪對A549細胞中COX

24、-2蛋白表達的影響:培養(yǎng)24小時后，IN組COX-2的蛋白表達較對照組減弱;而各川芎嗪培養(yǎng)組COX-2的蛋白表達和對照組相比無明顯差別，提示川芎嗪對A549細胞中COX-2的蛋白表達無明顯影響。
　　 (3)川芎嗪對A549細胞分泌PGE2的影響:A549細胞與200μM吲哚美辛(IN)培養(yǎng)24小時后，細胞上清液中PGE2的濃度較對照組明顯降低。與IN組相似，各川芎嗪培養(yǎng)組PGE2的濃度較對照組均明顯降低，差異具有顯著性(p＜0

25、.05)。TMP200、TMP400和TMP800各組間未表現(xiàn)出明顯差別。
　　 (4)川芎嗪對A549細胞肺轉(zhuǎn)移瘤組織中COX-2表達的影響:川芎嗪治療組裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤COX-2染色陽性細胞和顆粒顏色均較對照組明顯降低。
　　 結(jié)論:
　　 (1)川芎嗪可抑制A549細胞中COX-2的酶活性和肺轉(zhuǎn)移瘤組織中COX-2的表達，對A549細胞中COX-2的蛋白表達無明顯影響。
　　 (2)COX-2是川芎嗪抑

26、制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要作用靶點之一。
　　 3.研究的限制性
　　 本研究初步只觀察了川芎嗪對肺癌A549這一個細胞系的作用，關(guān)于COX-2介導的川芎嗪抑制NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的作用，還需進一步利用更多的NSCLC細胞系進行觀察，以使結(jié)果更為翔實。
　　 4.研究創(chuàng)新點
　　 (1)通過細胞實驗和動物實驗觀察了川芎嗪對肺癌A549細胞的作用，結(jié)果顯示川芎嗪能夠抑制A549細胞的增殖，并在更低的濃度和更早的時間

27、顯示出更為突出的抗腫瘤侵襲作用。
　　 (2)首次觀察了川芎嗪對肺癌A549細胞COX-2的作用，結(jié)果顯示川芎嗪能夠抑制A549細胞COX-2的酶活性和轉(zhuǎn)移瘤組織中COX-2的表達。
　　 (3)首次揭示了COX-2是川芎嗪抑制肺癌A549細胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要作用靶點之一。
　　 5.意義
　　 本研究首次揭示了川芎嗪以COX-2為靶點的抗腫瘤作用，對川芎嗪抗腫瘤作用的分子機制進行了新的闡述，為進一步的研究