MLL2促進肺癌A549細胞發(fā)生發(fā)展中的作用機制及蘿卜籽素抑制肺癌A549細胞的生物信息學研究.pdf

1、目的：
　　肺癌對人類健康和生活造成巨大危害，并且肺癌五年生存率不到15％，是人類因癌癥死亡的主要原因。許多致癌物質都可以通過癌基因和抑癌基因的激活或抑制促使活細胞轉化為癌癥細胞。MLL2存在于各種上皮細胞和組織的癌細胞中，如前列腺癌，結腸癌，肺癌和肝癌中被發(fā)現。因為這些腫瘤細胞中MLL2基因啟動子的CpG島的甲基化顯著增加，因此它被認為是一種腫瘤基因。本研究主要針對MLL2對肺癌細胞的影響進行研究，討論了MLL2基因誘導人肺腺癌

2、 A549細胞增殖，遷移和侵襲的可能機制，研究了肺癌 MLL2基因對組蛋白H3和H4賴氨酸殘基甲基化的影響，最后通過生物信息學方法分析了可能的相關基因與信號轉導通路。
　　方法：
　　1、從構建過表達和基因沉默 MLL2的 A549肺癌細胞出發(fā)，研究這兩種A549肺癌細胞的生物學行為的影響。
　　2、通過脂質體轉染含有MLL2基因的質粒，RT-PCR法，WesternBlot，CCK-8細胞測定蛋白表達、以及A549肺

3、癌細胞增殖和集落形成。
　　3、采用熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測MLL2，MMP-2（基質金屬蛋白酶-2）， PKR（雙鏈RNA依賴性蛋白激酶）的mRNA表達，Western Blot檢測PKR、MLL2和MMP-2的表達；用Transwell小室進行遷移和侵襲實驗檢測A549細胞增殖。
　　4、過表達和沉默MLL2質粒轉染到人肺腺癌A549細胞，采用Western Blot和免疫熒光試驗檢測 MLL2對 H3K4me

4、3，H3k4me2，H3k4me1，H3K9me3， H3k9me2，H3k9me1，H3k27me3，H3k27me2，H3k27me1，H3k36me3，H3k36me2， H3k36me1，H4k20me3的甲基化狀態(tài)的作用。
　　5、采用R/Bioconductor分析和挖掘基因芯片的數據。下載GEO中包含經過蘿卜籽素處理前后的A549肺癌細胞的原始數據，然后進行標準化處理、質控、差異基因的篩選與分析、GO分析、聚類以及通

5、路總結，進一步的分析基因調控網絡以及分子相互作用。
　　結果：
　　我們成功構建了過表達MLL2的A549肺癌細胞，通過MTT法檢測，發(fā)現該細胞過度表達MLL2基因，與空載體組和對照組相比，過表達MLL2的細胞侵襲遷移顯著增加，同類細胞之間粘附降低，異質細胞粘附則增強了，而且擴散加速和集落形成率均發(fā)生了提高。此外，MLL2促使MMP-2 mRNA表達顯著增加；P-PKR蛋白的表達則降低；PKR mRNA的表達與對照組和空載體

6、組相比無顯著差異。
　　Western Blot分析表明，MLL2造成H3K9me3的表達削弱，而沉默MLL2增強H3K9me3的表達， H3組蛋白20位點和H4組蛋白4、27、36位點的甲基化狀態(tài)則沒有顯著差異。免疫熒光表明MLL2造成H3K9me3表達增強，并且與Western Blot結果一致。
　　最后，通過生物信息學的結果，我們發(fā)現了經過蘿卜籽素處理前后A549肺癌細胞與MLL2相關的癌基因發(fā)生了下調。