新型吡唑啉衍生物抑制肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和研究目的：
　　目前癌癥是除心臟病和腦血管病變以外的世界三大疾病之一，而在百余種不同病變的痛癥中，至今尚未發(fā)現(xiàn)有特效的治療方法。肺癌因其發(fā)現(xiàn)晚，高致死率在癌癥治療中成為一個(gè)全球性難題，而環(huán)境因素尤其是大氣污染和不良生活習(xí)慣如抽煙也加劇了這一病癥的發(fā)展。在所有類型的肺癌中，非小細(xì)胞肺癌占據(jù)比重高達(dá)85％，大概四分之三的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，且5年存活率極低。目前除了手術(shù)切除外，化療依舊是治療肺癌必不可少的手段。但化療藥物

2、副作用較大，病人化療過程十分痛苦。因此亟需開發(fā)新的抑制腫瘤生長(zhǎng)及發(fā)展的化合物。
　　目前化合物抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用主要表現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡等。抑制腫瘤增殪主要是通過阻滯細(xì)胞周期來實(shí)現(xiàn)的，利用化療藥物抑制細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而阻止細(xì)胞分裂，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。惡性腫瘤難以治愈的一個(gè)顯著特點(diǎn)就是其高轉(zhuǎn)移特性，腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)這一生理過程主要依賴于細(xì)胞遷移，因此，抑制腫瘤細(xì)胞

3、遷移也是治療腫瘤的有效手段。
　　自噬是哺乳動(dòng)物中普遍存在的機(jī)制，這一保守過程在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著極其重要的作用，在多種人類疾病，如神經(jīng)退行性疾病、免疫失調(diào)、心血管疾病、糖尿病尤其是癌癥中都發(fā)現(xiàn)不同程度的自噬失調(diào)。研究表明在多種癌癥發(fā)生中都存在自噬相關(guān)基因不同程度的缺失。細(xì)胞凋亡即程序性細(xì)胞死亡，誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡是很多抗癌藥物作用的經(jīng)典方式，而且自噬與凋亡關(guān)系密切，過度的自噬最終會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此研究腫瘤細(xì)胞的自噬和凋亡的相互關(guān)

4、系和作用，對(duì)于尋找腫瘤治療的新靶點(diǎn)，建立腫瘤治療的新策略都具有指導(dǎo)意義?；瘜W(xué)遺傳學(xué)利用具有細(xì)胞滲透性的化學(xué)小分子為研究工具，廣泛應(yīng)用在探究細(xì)胞信號(hào)通路和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持中?；瘜W(xué)小分子因其化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于進(jìn)細(xì)胞并且具有作用可逆等優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)水平調(diào)控，信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)以及免疫研究等領(lǐng)域。研究小分子化合物作用機(jī)制能為藥物開發(fā)提供先導(dǎo)化合物，從而縮短抗癌藥物開發(fā)過程，推動(dòng)腫瘤治療進(jìn)程。
　　綜上所述，本研究旨在運(yùn)用化學(xué)遺傳學(xué)手段，

5、篩選能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的化學(xué)小分子，并進(jìn)一步探究其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的具體機(jī)制，尋找小分子胞內(nèi)作用靶點(diǎn)，以期發(fā)現(xiàn)新的治療腫瘤的分子靶點(diǎn)，建立高效的腫瘤治療機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容：
　　1.篩選能夠抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)的化學(xué)小分子;
　　2.探究化學(xué)小分子在細(xì)胞內(nèi)的分布;
　　3.研究化學(xué)小分子在細(xì)胞水平及組織水平的作用效果;
　　4.研究化學(xué)小分子抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制;
　　研究方法：

6、r>　　1.A549及HUVECs細(xì)胞的培養(yǎng);
　　2.倒置熒光顯微鏡觀察A549細(xì)胞形態(tài)變化;
　　3.SRB法檢測(cè)細(xì)胞存活率;
　　4.AO染色檢測(cè)細(xì)胞核斷裂情況;
　　5.LDH法檢測(cè)細(xì)胞是否壞死;
　　6.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察LC3點(diǎn)狀聚集情況;
　　7.免疫印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ及mTOR的下游底物4EBP1，p70S6K的磷酸化水平變化;
　　8.RNA干擾研究化學(xué)小

7、分子抑制mTOR活性的作用機(jī)制;
　　9.免疫熒光法檢測(cè)mTOR，LC3與化學(xué)小分子共定位情況;
　　10.激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)小分子化合物在細(xì)胞中的亞定位;
　　11.免疫印跡法檢測(cè)化合物對(duì)p21和p27的水平影響;
　　12.流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布;
　　13.雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)化學(xué)小分子體內(nèi)腫瘤抑制效果。
　　研究結(jié)果：
　　1.化學(xué)小分子5a-5i的處理引起A549形態(tài)變得不規(guī)則

8、;
　　2.化學(xué)小分子5a-5i能顯著抑制A549細(xì)胞增殖，但對(duì)正常細(xì)胞HUVECs生長(zhǎng)無影響;
　　3.化學(xué)小分子5a-5i短時(shí)間處理不引起A549細(xì)胞凋亡;
　　4.除化合物5f外，其他化學(xué)小分子不誘導(dǎo)A549細(xì)胞壞死;
　　5.化學(xué)小分子5a-5i誘導(dǎo)細(xì)胞自噬;
　　6.化合物5e誘導(dǎo)mTOR依賴的完整自噬流;
　　7.化合物5e通過FKBP12抑制mTOR的活性;
　　8.化學(xué)小分子5a

9、-5i具有良好的熒光特性，5e與溶酶體共定位;
　　9.化合物5e抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)并且不影響正常血管生成;
　　10.化合物5e誘導(dǎo)實(shí)體瘤內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡;
　　11.化學(xué)小分子5a-5i能阻滯A549細(xì)胞周期;
　　12.化合物5e抑制A549細(xì)胞遷移。
　　結(jié)論：
　　1.化學(xué)小分子以濃度和時(shí)間依賴的方式抑制A549細(xì)胞增殖，其中化合物5e，5g，5h效果較好。
　　2.化合物在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)