經(jīng)腰椎穿刺注射干細(xì)胞內(nèi)耳移植新途徑的探索研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
　　目的：培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行比較，探討適用于大量培養(yǎng)以滿足體內(nèi)移植治療的細(xì)胞類型。
　　方法：使用組織塊貼壁法從臍帶組織中分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。培養(yǎng)、鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，繪制兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，并比較細(xì)胞形態(tài)。
　　結(jié)果：組織塊貼壁法成功分離

2、間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)鑒定其表型CD73(+)，CD105(+)，CD31（-），CD34（-），符合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞特點(diǎn)。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞NANOG(+)、OCT-4(+)、SOX-2(+)、SSEA-4(+)、TRA-60(+)和TRA-81(+)，符合誘導(dǎo)多能干細(xì)胞特點(diǎn)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞呈梭形，以漩渦樣排列，其倍增時(shí)間約42小時(shí)。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞呈圓形或橢圓形，呈集落生長(zhǎng)，其倍增時(shí)間約18小時(shí)。
　　結(jié)論：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能

3、干細(xì)胞增殖速度快，狀態(tài)穩(wěn)定，適合用于以移植治療為目的的大量繁殖。
　　第二部分 經(jīng)腰椎穿刺干細(xì)胞內(nèi)耳移植注射新途徑的探索研究
　　目的：摸索建立一種在人類感音神經(jīng)性耳聾大型哺乳動(dòng)物模型上可行的內(nèi)耳干細(xì)胞移植方法，檢測(cè)經(jīng)腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔注射移植的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在Mitf基因突變耳聾豬的內(nèi)耳及全身的分布情況，檢測(cè)對(duì)聽性腦干反應(yīng)閾值的影響。
　　方法：培養(yǎng)及鑒定人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。選擇Mitf基因突變的榮昌豬作為神經(jīng)性耳聾

4、模型的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，移植干細(xì)胞的榮昌豬為實(shí)驗(yàn)組，單純注射生理鹽水的榮昌豬為對(duì)照。將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔注射的途徑移植到實(shí)驗(yàn)組榮昌豬體內(nèi)。設(shè)置觀察期為移植后1天、移植后3天和移植后7天，在移植前和處死前行全身麻醉后測(cè)定聽性腦干反應(yīng)閾值。按觀察期的時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物取耳蝸及其他組織。制作冰凍組織切片，行免疫組織熒光染色，用人特異性抗體檢測(cè)供體細(xì)胞。提取蛋白質(zhì)，使用蛋白印跡法檢測(cè)移植細(xì)胞蛋白的表達(dá)。提取RNA，使用RT-PCR法檢測(cè)供體細(xì)胞基

5、因在實(shí)驗(yàn)對(duì)象體內(nèi)分布。
　　結(jié)果：經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔穿刺注射的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在移植后可以在實(shí)驗(yàn)對(duì)象內(nèi)耳檢出;同過蛋白質(zhì)印跡法在移植后1天、3天和7天可以在內(nèi)耳、腰椎段脊髓、胸椎段脊髓、頸椎段脊髓、延髓、小腦、大腦、心、肝、脾、肺、腎中檢出移植細(xì)胞的蛋白表達(dá)。通過RT-PCR方法移植后1天、3天和7天可以在腰椎段脊髓、胸椎段脊髓、頸椎段脊髓、延髓、小腦、大腦、心、肝、脾、肺、腎中檢出移植細(xì)胞的基因表達(dá)。在移植前后，Mitf基因突變榮昌豬