人臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)化骨髓間充質干細胞源膜微囊的途徑探索.pdf

1、間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）由于其較強的再生能力，免疫調(diào)節(jié)功能及多向分化的潛能被廣泛應用于再生醫(yī)學中，同時為缺血性心肌病的治療帶來了新的希望。然而，其具體的作用機制仍不清楚。近期大量的動物實驗發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的MSC進入體內(nèi)后，絕大多數(shù)細胞由于體內(nèi)存在的排斥反應和不適應機體內(nèi)缺血缺氧的微環(huán)境在72小時內(nèi)死亡，但是能顯著改善心功能。那么，死亡的MSC是如何發(fā)揮作用的呢？我們的前期研究表明，MSC在低氧

2、低營養(yǎng)的條件下可釋放大量膜微囊(microvesicles，MVs)，而且MV體外可內(nèi)化入內(nèi)皮細胞并促進其增殖、遷移和管狀結構形成，體內(nèi)也能促進缺血肢體血管新生。因此，至少在促進血管新生方面，MV可能是MSC發(fā)揮作用的主要介質。在上述過程中，內(nèi)皮細胞內(nèi)化MV是關鍵的步驟。然而，MSC來源的MV(MSC-MV)通過何種途徑進入內(nèi)皮細胞，至今未見系統(tǒng)的報告。
　　實驗目的：
　　膜微囊是細胞在激活或凋亡過程中釋放的一種囊泡結構，

3、其可攜帶母細胞的遺傳信息傳遞給靶細胞，被認為是細胞間信息傳遞的重要介質。通過對其內(nèi)化機制的研究可以為干細胞的臨床治療機制和膜微囊替代干細胞治療提供一定的理論基礎。
　　實驗方法：
　　1.利用密度梯度離心及差速貼壁的方法，分離純化人骨髓MSC（BMSC），并通過形態(tài)觀察、體外成骨和成脂肪能力以及細胞表型，對BMSC進行鑒定。
　　2.經(jīng)鑒定后的BMSC，在1％氧及無血清條件下誘導其凋亡，獲取細胞培養(yǎng)上清，經(jīng)超速離心分離

4、得到BMSC-MV，并通過電鏡對其形態(tài)進行鑒定，流式細胞術檢測MV表面標志物的表達，以確定BMSC-MV的來源及其基本特征。同時，用CFSE或DiI熒光染料對BMSC-MV進行標記觀察BMSC-MV內(nèi)化，。
　　3.以人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）為對象，用抗人的CD29和CD44抗體，和/或重組人膜聯(lián)蛋白V（Anx-V）預處理后的BMSC-MV后與HUVEC共培養(yǎng)，流式細胞術和共聚焦顯微術評價BMSC-MV內(nèi)化情況。此外，利用

5、干擾RNA（siRNA）轉染HUVEC，以特異抑制 Anx-V和磷脂酰絲氨酸受體（PSR）表達，進一步觀察BMSC-MV內(nèi)化的改變。
　　結果：
　　1.成功分離BMSC，并在特定誘導條件下，可分化為成骨細胞及成脂細胞。流式細胞術檢測示其表面高表達CD73，CD44，不表達CD45和CD31。
　　2.成功分離獲取BMSC-MV，并通過流式檢測證明其表面高表達與BMSC相同的表面分子CD73，CD44，不表達CD45和

6、CD31。同時高表達CD29，磷脂酰絲氨酸（PS）。
　　3.HUVEC可內(nèi)化BMSC-MV，并存在一定的時間及濃度依賴性效應，通過CD29，CD44抗體及外源性重組人Anx-V可以封閉BMSC-MV表面的相應的分子CD29，CD44，PS抑制其內(nèi)化。siRNA干擾HUVEC表面的Anx-V后，BMSC-MV內(nèi)化未見明顯變化；干擾PSR合成后BMSC-MV的內(nèi)化顯著減少。
　　結論：
　　（1）在低氧低營養(yǎng)的條件下，人