阿霉素通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞耐藥并誘導(dǎo)一種新CD44st表達(dá).pdf

1、目的：
　　1.應(yīng)用阿霉素(doxorubicin)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥，以此耐藥誘導(dǎo)模型為基礎(chǔ)檢測MDR1﹑CD44st表達(dá)變化，探討阿霉素誘導(dǎo)獲得性多藥耐藥與腫瘤侵襲相關(guān)基因及其蛋白表達(dá)的關(guān)系；
　　2.從MDR1﹑CD44st基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控入手，檢測誘導(dǎo)獲得性多藥耐藥過程中，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)﹑核移位及其與DNA的結(jié)合活性的變化，探討NF-κB對MDR1﹑CD44st表達(dá)的調(diào)控作用；
　　

2、3.應(yīng)用NF-κB特異性抑制劑預(yù)處理后，再用透明質(zhì)酸（hyaluronan HA）處理耐藥誘導(dǎo)模型，檢測腫瘤細(xì)胞MMP-2﹑MMP-9表達(dá)及侵襲力變化，探討NF-κB特異性抑制劑對HA誘導(dǎo)的侵襲能力影響。
　　方法：應(yīng)用四唑藍(lán)（MTT）比色法檢測不同濃度阿霉素對MCF-7細(xì)胞生長抑制的抑制效應(yīng)，從而找到合適的阿霉素濃度進(jìn)行藥物的誘導(dǎo)；Quantitative Real-Time聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）及半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反

3、應(yīng)(RT-PCR)檢測MDR1、NF-κB、CD44st、MMP-2及MMP-9基因表達(dá)水平變化，基因測序驗(yàn)證CD44st基因；流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)細(xì)胞膜P-gp表達(dá)率的變化；羅丹明123(Rho123)潴留實(shí)驗(yàn)檢測P-gp的功能狀態(tài)；Western blotting檢測CD44，NF-κB蛋白表達(dá)變化；凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)（EMSA）檢測NF-κB/DNA的結(jié)合活性；明膠酶譜分析檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清MMP-2，

4、MMP-9表達(dá)變化；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲力變化。
　　結(jié)果：
　　1.MTT結(jié)果顯示：阿霉素對MCF-7細(xì)胞的IC50值為0.68±0.04ug/m；應(yīng)用0.01，0.03，0.06及0.12ug/ml濃度的阿霉素作用MCF-7細(xì)胞7天后，細(xì)胞生長均受到抑制，與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；形態(tài)學(xué)觀察，阿霉素在0.03，0.06ug/ml組細(xì)胞，7d后MCF-7細(xì)胞僅出現(xiàn)輕度腫脹

5、，細(xì)胞狀態(tài)尚好，而0.12ug/ml組細(xì)胞狀態(tài)差，明顯腫脹，可見明顯的細(xì)胞碎片。因此，我們選擇阿霉素的誘導(dǎo)終濃度為0.06ug/ml用于后續(xù)研究。
　　2.qRT-PCR結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞MDR-1，CD44st及NF-κB基因表達(dá)水平較低，經(jīng)0.01﹑0.03﹑0.06ug/ml阿霉素作用后，上述基因表達(dá)水平逐漸增高，并呈劑量依賴性；各處理組細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞比較，及組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；RT-

6、PCR結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果相似；基因測序結(jié)果顯示該CD44st基因序列與此前我們發(fā)現(xiàn)的基因序列（Gene Bank FJ216964）一致。
　　3.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測結(jié)果顯示：MCF-7細(xì)胞組與各處理組比較，組間兩兩比較，P-gp表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.Rho123外排實(shí)驗(yàn)顯示：細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度隨P-gp表達(dá)增加而逐漸減少，呈反比關(guān)系（P＜0.05）。
　　5.Western blottin

7、g結(jié)果顯示，CD44及NF-κB蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)變化相一致。
　　6.EMSA檢測結(jié)果表明，隨著阿霉素用量的增加，NF-кB/DNA的結(jié)合活性呈劑量依賴性增加。
　　7.RT-PCR及明膠酶譜結(jié)果顯示，透明質(zhì)酸（HA）誘導(dǎo)了MCF-7/A0.06細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9，但這種作用可以被NF-кB特異性抑制劑BMS-345541所阻斷。
　　8.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HA可使MCF-7/A0.