伐地那非逆轉(zhuǎn)MCF-7-ADR細(xì)胞阿霉素耐藥的作用研究.pdf

1、目的：腫瘤的多藥耐藥（MDR）是癌癥化療失敗的重要原因，出現(xiàn)MDR的一類(lèi)主要機(jī)制在于磷酸腺苷ATP的結(jié)合盒—ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過(guò)度表達(dá)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以增加癌細(xì)胞中藥物的流出,從而減少細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，產(chǎn)生MDR。研究腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑有望找到克服耐藥的方法，減少癌癥復(fù)發(fā)，提高治療效果，改善患者生活質(zhì)量。近些年開(kāi)發(fā)的MDR逆轉(zhuǎn)劑的化學(xué)藥物大部分是P-gp抑制劑，通過(guò)抑制P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)活性或者與化療藥物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 P-gp的底物結(jié)合位點(diǎn)來(lái)抑制其

2、功能，從而增加化療藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的積蓄，逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR。但是耐藥逆轉(zhuǎn)的研究多數(shù)停留在體外研究階段，目前的耐藥逆轉(zhuǎn)劑常因其特異性低以及副作用大使其臨床應(yīng)用受到明顯限制，因此尋找低毒有效的MDR逆轉(zhuǎn)劑是治療腫瘤的有效而長(zhǎng)期的探索過(guò)程。伐地那非作為新一代磷酸二酯酶5（PDE5）抑制劑口服吸收好，安全性高，在轉(zhuǎn)染 MRP7的HEK293細(xì)胞上，這類(lèi)藥物可以增強(qiáng)對(duì)化療藥物的敏感性，但其其逆轉(zhuǎn)耐藥的作用及機(jī)制尚有許多未解之處。乳腺癌是婦女中發(fā)病率

3、較高的惡性腫瘤。本研究在人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR上探討PDE5抑制劑伐地那非的逆轉(zhuǎn)耐藥作用，并進(jìn)一步在整體荷瘤動(dòng)物模型上研究其耐藥作用。
　　方法：
　　1.采用MTT法檢測(cè)伐地那非、西地那非、他達(dá)拉非聯(lián)合阿霉素對(duì)人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞增殖的影響。
　　2.采用 Hoechst33342染色檢測(cè)伐地那非聯(lián)合阿霉素對(duì)人乳腺癌MFC-7/ADR細(xì)胞凋亡的影響。
　　3.采用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSC

4、M）檢測(cè)伐地那非對(duì)阿霉素在MFC-7/ADR細(xì)胞中積累和分布的影響。
　　4.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）檢測(cè)伐地那非對(duì)阿霉素在MCF-7/ADR細(xì)胞不同部位含量的影響。
　　5.Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)伐地那非對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞p-gp、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的影響。
　　6.建立BALB/c Nude小鼠乳腺癌耐藥模型，研究伐地那非逆轉(zhuǎn)荷瘤小鼠阿霉

5、素耐藥的體內(nèi)藥效學(xué)作用。分組給藥后，測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)速度，并檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.伐地那非、西地那非和他達(dá)拉非逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞阿霉素耐藥的作用:單獨(dú)給予阿霉素和伐地那非、西地那非或他達(dá)拉非時(shí)，MCF-7/ADR細(xì)胞的生長(zhǎng)作用未受明顯抑制。但二者合用可顯著提高細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，聯(lián)合給予阿霉素和伐地那非、西地那非或他達(dá)拉非均能顯著抑制MCF-7/ADR細(xì)胞生長(zhǎng)，且隨著伐地那非、西地那非或他達(dá)拉非濃

6、度的增加，逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥的作用明顯增強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率顯著提高。三種藥物相比較，以伐地那非逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞阿霉素耐藥的作用最強(qiáng)。
　　2伐地那非聯(lián)用阿霉素對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡的影響:正常組細(xì)胞的細(xì)胞核被染成彌散均勻的藍(lán)色，呈圓形。單獨(dú)使用阿霉素或者伐地那非后，細(xì)胞核形態(tài)、熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，均未出現(xiàn)細(xì)胞核濃縮等凋亡細(xì)胞特有的變化。伐地那非聯(lián)合阿霉素作用后，能引起MCF-7/ADR細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)明

7、顯的凋亡特征，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮，邊聚，形成新月?tīng)睢?br>　　3.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)藥物對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)阿霉素含量以及分布的影響:對(duì)照組和伐地那非組未顯示明顯的熒光，給藥6h后阿霉素組和聯(lián)合用藥組可看到明顯的熒光。伐地那非和阿霉素聯(lián)合用藥組的熒光強(qiáng)度明顯高于阿霉素單獨(dú)用藥組。將阿霉素的紅色熒光與細(xì)胞核的藍(lán)色熒光，以及與線(xiàn)粒體的綠色熒光merge的結(jié)果顯示，阿霉素在細(xì)胞核和線(xiàn)粒體均有明顯的分布。
　　4.HPLC-MS檢

8、測(cè)伐地那非對(duì)細(xì)胞內(nèi)阿霉素分布的影響:伐地那非可顯著提高細(xì)胞核，細(xì)胞漿和線(xiàn)粒體中阿霉素的濃度，其中細(xì)胞核中阿霉素的濃度最高，其次是細(xì)胞漿和線(xiàn)粒體。在細(xì)胞核中，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)聯(lián)合用藥組阿霉素的含量均比單獨(dú)阿霉素組要高，且隨著給藥時(shí)間增加，聯(lián)合用藥組細(xì)胞核中阿霉素的含量逐漸增高。在細(xì)胞漿中，各時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與單獨(dú)給藥組相比，伐地那非聯(lián)合用藥組阿霉素的含量都呈顯著性增加，6 h時(shí)，聯(lián)合用藥組細(xì)胞漿阿霉素含量最高。線(xiàn)粒體中阿霉素的含量較細(xì)胞核

9、和細(xì)胞漿低，2 h時(shí)，聯(lián)合用藥組的阿霉素含量與單獨(dú)使用阿霉素組相比并未顯著性增加，6 h和12 h時(shí)，聯(lián)合用藥組的阿霉素含量較阿霉素單獨(dú)用藥組明顯增加，但12 h時(shí)較6 h時(shí)阿霉素的含量有所降低。
　　5.藥物對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白 p-gp、Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的影響：與對(duì)照組相比較，阿霉素單獨(dú)用藥組和伐地那非組Bax/Bcl-2比值沒(méi)有顯著性變化，阿霉素和伐地那非聯(lián)合用藥組

10、的Bax/Bcl-2比值顯著升高。對(duì)照組、阿霉素組、伐地那非組和聯(lián)合用藥組之間 p-gp的表達(dá)沒(méi)有顯著性變化。對(duì)照組、阿霉素組、伐地那非組沒(méi)有cleaved-caspase3蛋白表達(dá)，在聯(lián)合用藥組，可看到cleaved-caspase3蛋白表達(dá)明顯升高。
　　6.伐地那非聯(lián)合阿霉素治療MCF-7/ADR荷瘤鼠的藥效學(xué)評(píng)價(jià):連續(xù)給予耐藥乳腺癌MCF-7/ADR小鼠藥物35天，稱(chēng)量體重，并記錄腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)。與對(duì)照組相比，阿霉素單獨(dú)用藥

11、組以及聯(lián)合用藥組體重有所減輕，伐地那非組小鼠體重沒(méi)有明顯變化。與對(duì)照組比較，阿霉素單獨(dú)用藥組和伐地那非組腫瘤生長(zhǎng)速度沒(méi)有顯著性差異，聯(lián)合用藥組腫瘤生長(zhǎng)速度顯著降低。與對(duì)照組相比，聯(lián)合用藥組Bax/Bcl-2比值顯著升高，其他組沒(méi)有明顯變化。各組之間 p-gp的表達(dá)沒(méi)有顯著性變化。在聯(lián)合用藥組，可看到cleaved-caspase3蛋白表達(dá)明顯升高。
　　結(jié)論：
　　1.伐地那非，西地那非，他達(dá)拉非和阿霉素單獨(dú)給藥則不影響細(xì)胞