Ophiobolin O通過周期阻滯和凋亡在體內(nèi)外逆轉耐藥細胞MCF-7-ADR的機制研究.pdf

1、越來越多的臨床和實驗數(shù)據(jù)表明，乳腺癌為我國常見惡性腫瘤之一，也是我國惡性腫瘤防治研究的重點。死亡率在惡性腫瘤中居第二位，僅次于胃癌和食管癌。手術切除是目前治療早期乳腺癌唯一有效的方法，但大多數(shù)患者就診時已達病程中晚期，手術療效受限，因而尋找新的治療方法尤為重要。隨著對腫瘤發(fā)生機制的深入研究，探討誘導腫瘤細胞凋亡和細胞周期阻滯的方法成為提高臨床療效的新思路。目前臨床上治療腫瘤出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象，多藥耐藥(MDR)系指腫瘤細胞對1種抗腫瘤藥物出

2、現(xiàn)耐藥性的同時，對其他多種結構不同、作用靶位不同的抗腫瘤藥物也有耐藥性。隨著腫瘤化療藥物的廣泛應用，腫瘤的耐藥性問題越來越突出，已成為腫瘤有效治療的主要障礙之一。目前研究腫瘤耐藥機制主要是從MDR基因表達的產(chǎn)物入手，探討此類產(chǎn)物引起的耐藥機制。主要有P-糖蛋白(P-gP)、細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽轉移酶(GST)、DNA拓撲異構酶Ⅰ、Ⅱ(TOPOⅠ、Ⅱ)、多藥耐藥相關蛋白（MRP）和肺耐藥蛋白(LRP)等。
　　

3、 本課題研究一種新的化合物蛇孢假殼素(ophoiobolin)對乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR的作用，蛇孢假殼素O是從中國海洋大學提供的12種微生物提取物中篩選出來的抗腫瘤活性較好的化合物，屬于蛇孢假殼素類二倍半萜化合物，其分子量為434.39。國內(nèi)外文獻未曾報道過這種化合物的抗腫瘤活性。本論文選取人乳腺癌耐阿霉素細胞MCF-7/ADR作為實驗對象，來研究Ophiobolin O對其增殖，周期和凋亡的影響及其作用機制。
　　

4、研究目的:研究Ophiobolin O對MCF-7/ADR細胞增殖，周期和凋亡的影響及其作用機制。
　　 研究方法:采用MTT法檢測Ophiobolin O對人乳腺癌細胞株MCF-7人乳腺癌耐藥細胞株MCf-7/ADR增殖的影響;采用流式細胞儀Propidium Iodide(PI)單標法檢測Ophiobolin O對MCF-7/ADR細胞周期進程的影響;Real-time PCR檢測耐藥基因mRNA表達的變化;采用流式細胞儀A

5、nnexin V-FITC/PI雙標法和PI單標的sub-G1（細胞亞二倍體凋亡峰）法檢測細胞凋亡率;應用Hoechst33342和DAPI熒光染色法觀察Opho-和ADM處理后細胞形態(tài)的變化;western blotting檢測凋亡蛋白和周期表達水平;采用流式細胞儀JC-1染色法檢測線粒體膜電位（△Ψm）水平;采用流式細胞儀檢測熒光探針DCFH-DA標記的細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS);用wes

6、tern blotting檢測凋亡通路蛋白表達;用NAC和ROS抑制劑檢測JC-1和ROS水平，動物體內(nèi)實驗檢測Ophiobolin O和ADM的抑瘤率;轉染實驗檢測細胞內(nèi)MDR1基因啟動子水平高低。
　　 結果:Ophiobolin O可抑制MCF-7/ADR細胞增殖，其作用具有濃度依賴性，在作用MCF-7/ADR細胞48h，后，ADMIC50為6.67±0.16μM，0.1μ M Ophiobolin O作用MCF-7/AD

7、R細胞后流式細胞儀檢測細胞周期進程和sub-G1的結果顯示，與對照組相比，隨著濃度的增高，G2/M期的細胞百分數(shù)逐漸增多(p＜0.05)，而S期的細胞百分數(shù)逐漸減少(p＜0.05)，G0/G1期細胞百分數(shù)基本保持不變，表明Ophiobolin O+ADM阻滯細胞于G2/M期，說明Ophiobolin O具有誘導MCF-7/ADR細胞凋亡的作用。流式細胞儀Annexin V/PI雙標檢測凋亡率的結果也顯示隨著藥物作用時間的延長，早期凋亡細

8、胞(Annexin V+/PI-)占總細胞數(shù)的比例也不斷增加(p＜0.05)，進一步證明Ophiobolin O具有誘導MCF-7/ADR凋亡的作用。通過熒光染料Hoechst33342和DAPI檢測細胞形態(tài)學改變的結果顯示Ophiobolin O作用MCF-7/ADR細胞48h后可見典型的凋亡形態(tài)學改變，表現(xiàn)為部分細胞胞質(zhì)縮小，胞質(zhì)濃縮，核染色體高度凝聚、邊緣化，細胞核碎裂呈碎片狀，可見典型的新月形凋亡小體，而正常對照組的細胞核完整。