抑制NF-κB誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡.pdf

1、肝纖維化的本質(zhì)是肝臟細(xì)胞外間質(zhì)纖維生成和降解失平衡的結(jié)果,而活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源,HSC的活化、增殖是肝纖維化發(fā)生的中心事件。HSC的活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),與靜止及過(guò)渡期的HSCs比較,活化的HSCs能高水平表達(dá)Ⅰ型膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1,在肝纖維化形成過(guò)程中,HSC數(shù)量是增多的;而在肝纖維化的逆轉(zhuǎn)過(guò)程中其數(shù)量是減少的。當(dāng)前,抗肝纖維化治療主

2、要策略是減少活化HSC總數(shù)量,而實(shí)現(xiàn)這一目的的主要途徑有二個(gè):一是將活化的HSCs逆轉(zhuǎn)為靜止的;二是促進(jìn)活化HSCs凋亡,使其總體數(shù)量減少。由于HSC的活化是個(gè)不連續(xù)的多階段過(guò)程,將活化的HSCs逆轉(zhuǎn)幾乎是不可能的,因此,減少HSC活化、增殖,促進(jìn)HSCs凋亡,減少其數(shù)量,減少ECM,成為肝纖維化治療的主要策略。
　　 HSCs不僅是肝臟炎癥過(guò)程的靶細(xì)胞,更是炎癥的效應(yīng)細(xì)胞,這一觀念的改變,代表著肝纖維化研究領(lǐng)域的最新進(jìn)展。NF

3、-κB(nuclear factorkappa B)及其調(diào)控系統(tǒng)是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在肝纖維化形成過(guò)程中,枯否氏細(xì)胞(Kupffer cell,KC)可以被細(xì)胞變性、壞死釋放的脂質(zhì)過(guò)氧化物、細(xì)胞因子等炎性介質(zhì)激活而分泌大量的細(xì)胞因子、趨化因子等促炎介質(zhì)及活性氧等,這些物質(zhì)可啟動(dòng)或加劇肝臟炎癥反應(yīng)。NF-κB作為炎癥反應(yīng)最為重要的轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)KC分泌上述介質(zhì)進(jìn)行調(diào)控。肝損傷時(shí)由于腸道細(xì)菌和腸壁通透性增加,門(mén)脈系統(tǒng)和血液循環(huán)中的脂

4、多糖(lipopolysaccharide,LPS)水平增加,后者通過(guò)HSC TLR4受體活化NF-κB?；罨腍SCs內(nèi)NF-κB活性增強(qiáng),導(dǎo)致炎性因子表達(dá)增加,放大肝臟炎癥損傷反應(yīng),促進(jìn)了HSC的活化;與此同時(shí),NF-κB在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用,NF-κB能抑制多種類(lèi)型的細(xì)胞凋亡。NF-κB活性增強(qiáng)可減少HSC凋亡,促進(jìn)其活化、增殖及移動(dòng)。因此,通過(guò)抑制NF-κB活性,對(duì)減少HSC活化,促進(jìn)HSC凋亡,減少ECM,有重要作用,將有

5、可能成為逆轉(zhuǎn)肝纖維化新策略,并將產(chǎn)生重大影響。本研究通過(guò)小干擾RNA(shortinterfering RNA,siRNA)技術(shù)抑制HSC NF-κB基因及其對(duì)促進(jìn)活化的HSC凋亡,凋亡機(jī)制以及ECM代謝的影響,證明了抑制NF-κB活性可促進(jìn)活化HSC凋亡,減少ECM合成,加強(qiáng)其降解,從而有利于抗肝纖維化治療;以此為啟發(fā)點(diǎn),進(jìn)一步研究了雙環(huán)醇對(duì)NF-κB活性的抑制作用,探討了其對(duì)促進(jìn)活化HSC凋亡作用的影響、作用機(jī)制及對(duì)活化HSC EC

6、M代謝的調(diào)節(jié)作用,為雙環(huán)醇用于抗肝纖維治療提供了理論依據(jù);本研究還探討了雙環(huán)醇對(duì)四氯化碳引起的急性肝損傷保護(hù)作用機(jī)制與NF-κB關(guān)系,證實(shí)雙環(huán)醇可通過(guò)抑制NF-κB活性,減少氧應(yīng)激,減少炎癥因子的表達(dá),保護(hù)肝細(xì)胞,減少HSC活化,從而有利于肝纖維化的防治。
　　 第一部分:靶向NF-κB的小干擾RNA誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡作用、分子機(jī)制及對(duì)ECM代謝的影響
　　 目的:NF-κB通路在肝星狀細(xì)胞凋亡調(diào)控中起重要作用,抑制NF

7、-κB活性的藥物可促進(jìn)HSC凋亡,逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化,本文應(yīng)用小分子干擾RNA技術(shù)沉默NF-κB p65基因,觀察其對(duì)HSC凋亡、凋亡機(jī)制和ECM的影響。
　　 方法:選用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000作為轉(zhuǎn)染試劑,將針對(duì)NF-κB p65亞基的siRNA轉(zhuǎn)染HSCs-T6細(xì)胞72h后,再與脂多糖LPS孵育1h,然后實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NF-κB p65、Ⅰ型前膠原、TIMP-1、α-SMA、TGF

8、β1和抗凋亡蛋白A1 mRNA表達(dá),Western blot檢測(cè)NF-κB p65和Bcl-2蛋白表達(dá),酶譜法檢測(cè)MMP-2活性,流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL及caspase-3活性檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論:NF-κB介導(dǎo)的siRNA下調(diào)靶基因NF-κB的表達(dá),誘導(dǎo)HSCs細(xì)胞凋亡誘導(dǎo),激活MMP-2活性,減少Ⅰ型前膠原、α-SMA、TGFβ1和TIMP-2表達(dá),有利于抗肝纖維化,其機(jī)制可能與下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和A1表達(dá)有關(guān)。

9、
　　 第二部分:雙環(huán)醇對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡、凋亡機(jī)制和ECM代謝的影響
　　 目的:探討雙環(huán)醇對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖、凋亡作用的影響;雙環(huán)醇對(duì)NF-κB活性的抑制作用;雙環(huán)醇對(duì)Caspase3、線粒體膜電位的影響;雙環(huán)醇對(duì)HSC-T6細(xì)胞ECM代謝的影響,為雙環(huán)醇治療肝纖維化提供理論依據(jù)。
　　 方法:體外培養(yǎng)HSC-T6,觀察H2O2不同時(shí)間對(duì)NF-κB活化作用,然后給予雙環(huán)醇處理,觀察雙環(huán)醇對(duì)H2O2誘導(dǎo)

10、的NF-κB活化的抑制作用;觀察不同時(shí)間、不同劑量雙環(huán)醇對(duì)HSC-T6凋亡的影響及機(jī)制,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NF-κB p65、Ⅰ型前膠原、TIMP-1、α-SMA、TGFβ1和抗凋亡蛋白A1 mRNA表達(dá),Western blot檢測(cè)NF-κB p65表達(dá);Hoechst3325染色后熒光顯微鏡檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞凋亡;激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)雙環(huán)醇對(duì)線粒體膜電位的影響。
　　 結(jié)論:雙環(huán)醇可誘導(dǎo)HSC-

11、T6細(xì)胞凋亡;抑制H2O2誘導(dǎo)的NF-κB活化;促進(jìn)HSC-T6 Caspase3活性、降低線粒體膜電位;減ⅠI型前膠原、TIMP-1、α-SMA和TGF-β1 mRNA表達(dá),其機(jī)制可能與抑制抗凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。
　　 第三部分雙環(huán)醇對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用
　　 目的:研究雙環(huán)醇對(duì)CCL4致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用;對(duì)NF-κB及其調(diào)控炎癥因子抑制作用;對(duì)HSC活化的影響。
　　 方法:60只雄

12、性昆明小鼠(28±2.2)g,隨機(jī)分為6組,即正常對(duì)照組、肝損傷組、NF-κB抑制劑組、雙環(huán)醇低劑量組(0.5 mg/ml/10g)、雙環(huán)醇中劑量組(1 mg/ml/10g)、雙環(huán)醇高劑量組(5 mg/ml/10g)。實(shí)驗(yàn)第一天,第二天雙環(huán)醇各組動(dòng)物均灌服相應(yīng)藥物0.04 ml/10g/d。對(duì)照組和肝損傷組均灌服生理鹽水0.04 ml/10g。第三天除對(duì)照組外,各組均腹腔注射0.1％CCL40.1ml/10g,對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.

13、1ml/10g,注射后兩小時(shí),雙環(huán)醇各組繼續(xù)灌服相應(yīng)藥物0.04ml/10g/d,對(duì)照組和肝損傷組灌服生理鹽水0.04ml/10g,第五天,灌胃后兩小時(shí),所有動(dòng)物處死,分離血清-20℃保存以備測(cè)ALT、AST,取肝右葉-70℃保存以備測(cè)MDA、SOD,取部分肝左葉于冰上速切成約1mm3的小塊,4％戊二醛4℃固定,以備透射電鏡觀察。取部分肝左葉10％甲醛固定,用于HE染色和ICAM-1、COX-2、α-SMA及NF-κB免疫組組織化學(xué)染色