解脲脲原體LAMPs通過(guò)激活NF-κB誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)iNOS和凋亡.pdf

1、目的:研究從解脲脲原體(Uu)提取的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(LAMPs)在體外誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)及產(chǎn)生一氧化氮(NO)的水平，研究該膜蛋白能否激活小鼠巨噬細(xì)胞中核因子kappaB(NF-κB)及誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況，以便了解Uu潛在的致病性，為進(jìn)一步探討UuLAMPs誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)iNOS及誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:用從Uu提取的LAMPs刺激小鼠巨噬細(xì)胞，用Griess試劑測(cè)定經(jīng)

2、刺激后的小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO水平，以RT-PCR和Westernblot方法分析iNOS的表達(dá)水平，用細(xì)胞免疫組化、間接免疫熒光檢測(cè)NF-κB的激活，用Westernblot檢測(cè)核提取物中NF-κB蛋白的表達(dá)，且利用RT-PCR和Westernblot方法檢測(cè)NF-κB的特異性抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)和蛋白酶抑制劑放線菌酮(CHX)對(duì)iNOS的表達(dá)及對(duì)NF-κB激活的影響。用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)經(jīng)UuLAMPs處理的小

3、鼠巨噬細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果:UuLAMPs能誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)iNOS，且能以時(shí)間和劑量依賴方式刺激小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，當(dāng)LAMPs的濃度為3μg/mL時(shí)產(chǎn)生的NO量最多，為13.56±0.54μmol/L；但當(dāng)LAMPs從3μg/mL增加到5μg/mL時(shí)，NO產(chǎn)生的量反而減少。另外當(dāng)LAMPs刺激細(xì)胞4h后即可從培養(yǎng)基中檢測(cè)到NO，而刺激32h后產(chǎn)生的NO量則達(dá)到高峰。在用該膜蛋白與NF-κB的抑制劑PDTC或蛋白酶抑制劑放線菌酮

4、(CHX)共同處理巨噬細(xì)胞后，iNOS表達(dá)水平及所產(chǎn)生的NO能被部分抑制(P＜0.01)。UuLAMPs處理小鼠巨噬細(xì)胞2h后，其細(xì)胞漿內(nèi)的NF-κB即被激活，使其從細(xì)胞漿中轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)；另外，UuLAMPs刺激小鼠巨噬細(xì)胞8h后，即可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，16h后誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡而PDTC能抑制LAMPs誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)論:1.UuLAMPs能誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)iNOS和產(chǎn)生NO；2.UuLAMPs能誘導(dǎo)