色甘酸鈉影響大鼠增生性瘢痕形成的實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠深度創(chuàng)面模型，使用肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑色甘酸鈉干預(yù)創(chuàng)面愈合過程中肥大細(xì)胞的作用，通過觀察愈合后瘢痕增生情況并檢測肥大細(xì)胞數(shù)量、類胰蛋白酶等相關(guān)指標(biāo)，探究以肥大細(xì)胞作為瘢痕預(yù)防和治療靶點(diǎn)的可行性。
　　方法：選取40只雄性SD大鼠，隨機(jī)將其等分為A、B、C、D四組，每組10只，A、B、C組為實(shí)驗(yàn)組，其中A組為大劑量色甘酸鈉組（40mg/kg）， B組為中劑量色甘酸鈉組（20mg/kg），C組為小劑量色甘酸鈉組（10

2、mg/kg）， D組為陰性對照組。使用脫毛劑對所有實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行背部脫毛后，麻醉?xiàng)l件下于背部脊柱兩側(cè)用手術(shù)刀形成兩個對稱的面積約15mm*10mm*2mm的切割傷深度創(chuàng)面。創(chuàng)面以2％稀釋碘伏溶液消毒后予以暴露，每日觀察大鼠背部創(chuàng)面情況（是否有滲血和異常滲液）。分別于術(shù)前30min；術(shù)后第24、第48、第72小時，對A、B、C組所有實(shí)驗(yàn)對象腹腔注射對應(yīng)劑量色甘酸鈉溶液，D組注射相等體積生理鹽水。記錄創(chuàng)面初始面積，定期觀察創(chuàng)面面積大小，并在術(shù)

3、后第3d取背部左側(cè)創(chuàng)面組織，對組織進(jìn)行固定脫水及常規(guī)HE染色，行甲苯胺藍(lán)染色（肥大細(xì)胞計數(shù)）、免疫組化染色（類胰蛋白酶）等處理。記錄全部實(shí)驗(yàn)對象創(chuàng)面愈合時間，組間取其均數(shù)進(jìn)行比較。術(shù)后第42d處死所有實(shí)驗(yàn)對象，并收集背部右側(cè)瘢痕組織，對其進(jìn)行常規(guī) HE染色。肥大細(xì)胞計數(shù)：組織切片后使用甲苯胺藍(lán)染色法，用Image-pro6.0圖像分析軟件系統(tǒng)，在雙盲高倍鏡下（×400）連續(xù)計數(shù)單位面積（個/mm2），每張隨機(jī)挑選5個視野，計數(shù)其中肥大細(xì)

4、胞的總數(shù)后，取其平均值作為該實(shí)驗(yàn)對象最終數(shù)據(jù)。并對脫顆粒和未脫顆粒進(jìn)行定義。脫顆粒后肥大細(xì)胞胞膜不完整，邊界模糊，且周圍可見散在顆粒物質(zhì)分布。而完整肥大細(xì)胞形態(tài)相對完整規(guī)則，與周邊組織交界分明。類胰蛋白酶分析方法：免疫組化染色后，用Image-pro6.0圖像分析軟件系統(tǒng)，雙盲高倍鏡下（×400）連續(xù)計數(shù)單位面積（個/mm2），同樣每張切片隨機(jī)選取5個視野，記錄其中胰蛋白酶陽性肥大細(xì)胞數(shù)，并取其平均值作為最后結(jié)果。
　　結(jié)果：1、

5、創(chuàng)面初始面積：通過方差分析進(jìn)行組間比較后再兩兩比較均可得P＞0.05，提示所有實(shí)驗(yàn)對象創(chuàng)面初始面積無統(tǒng)計學(xué)差異。2、創(chuàng)面愈合時間：通過方差分析進(jìn)行組間比較后再兩兩比較均可得P＞0.05，提示所有實(shí)驗(yàn)對象創(chuàng)面愈合時間無統(tǒng)計學(xué)差異。3、瘢痕面積及硬度：術(shù)后第42天，見所有實(shí)驗(yàn)對象背部創(chuàng)面均出現(xiàn)瘢痕愈合，顏色呈淡紅或蒼白色，組間比較瘢痕面積大小關(guān)系提示：C組＞D組＞B組＞A組。D組瘢痕組織較硬；A、B組兩組瘢痕質(zhì)韌，組間無明顯差異；而C組位于

6、兩者之間。4、HE染色后鏡下觀察，術(shù)后第3天：A、B兩組創(chuàng)面情況類似，可見炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞散在分布，但新生毛細(xì)血管數(shù)量不多；D組鏡下見細(xì)胞結(jié)構(gòu)混亂，炎性細(xì)胞及成纖維細(xì)胞數(shù)量多，分布凌亂，且見豐富毛細(xì)血管。C組炎性細(xì)胞及成纖維細(xì)胞不及D組豐富，但遠(yuǎn)多于A、B兩組。術(shù)后第42天：D組瘢痕組織內(nèi)大量成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和毛細(xì)血管分布，部分呈環(huán)形或螺旋樣分布，炎性細(xì)胞數(shù)量不多，纖維組織散在分布，無明顯條理性；C組瘢痕組織顏色較D組淺，鏡下

7、可見成纖維細(xì)胞明顯少于D組，排列尚規(guī)則，膠原纖維排列較D組整齊，細(xì)胞外基質(zhì)不多，散在分布少量毛細(xì)血管；而A組、B組瘢痕組織增生不明顯，鏡下見成纖維細(xì)胞排列較緊密、有序，纖維組織排列整齊有序。5、肥大細(xì)胞計數(shù)：切片行甲苯胺藍(lán)染色法后，在顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)各組間肥大細(xì)胞總數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但A、B兩組脫顆粒細(xì)胞數(shù)明顯少于D組，C組位于兩者之間，相應(yīng)脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)/肥大細(xì)胞總數(shù)比例：D組＞C組＞A組≈B組。6、類胰蛋白酶計數(shù)：術(shù)后第3

8、天，接受到刺激信號后的肥大細(xì)胞開始表達(dá)類胰蛋白酶，D組類胰蛋白酶陽性肥大細(xì)胞數(shù)量明顯少于A組、B組，C組數(shù)量位于兩者之間。類胰蛋白酶陽性肥大細(xì)胞數(shù)：B組＞A組＞C組＞D組。
　　結(jié)論：1、色甘酸鈉可以顯著抑制肥大細(xì)胞脫顆粒，減輕早期炎癥反應(yīng)；但不影響局部組織中肥大細(xì)胞數(shù)量，且不影響創(chuàng)面愈合時間；2、色甘酸鈉可以有效減少創(chuàng)面愈合后瘢痕的形成；3、通過對比使用不同劑量色甘酸鈉，發(fā)現(xiàn)抑制大鼠肥大細(xì)胞脫顆粒的最佳有效劑量為20mg/kg；