維藥異常黑膽質成熟劑對增生性瘢痕影響的實驗研究.pdf

1、瘢痕（Scar）是機體創(chuàng)傷愈合的必然產物。病理性瘢痕由于瘢痕增生過度，從而引起外形和（或）功能異常。增生性瘢痕（Hypertrophic Scar, HS）是臨床最常見的病理性瘢痕之一，造成患者外觀畸形和功能異常，給患者身體及心理帶來了較大的影響。由于其具體機制尚不十分清楚，且治療后易復發(fā)等特點，當前尚無較好的防治手段。增生性瘢痕的形成是多環(huán)節(jié)、多階段的一個復雜過程，包括凝血、早期炎癥、晚期炎癥、成纖維細胞的遷移與膠原的合成、血管化、上

2、皮化、重塑階段等。傳統(tǒng)治療方法包括局部加壓、激素注射、硅凝膠類以及放化療等雖然取得了一定效果，但在治療HS的同時，會出現副作用或不良反應，臨床應用受到一定限制。
　　在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中，HS認為是由于氣血壅滯、經絡痹阻、痰濕搏結或三者聯合所致，且基于活血化瘀、攻毒散結、通絡止痛、酸澀收斂和消結散瘢等方法在增生性瘢痕的防治上取得了一定進展。雖然目前報道的中醫(yī)治療瘢痕的方法很多，但多數存在用藥途徑比較單一、劑型有限、多集中在單味藥物或是

3、提取物研究等缺陷，且療效不確切，容易復發(fā)等缺點。
　　維醫(yī)理論認為體液是人類生命及生理活動過程的基本物質體內各種營養(yǎng)物質在肝中產生的各種液體總稱為體液，分為膽液質、血液質、粘液質和黑膽質四種。它們貫穿于整個人生，在體內自然形成，對健康和疾病起很大的作用。它們在體內不斷地消耗，又不斷地產生，保持著一定的平衡狀態(tài)。四體液脫離自然的正常狀態(tài)，在數量和質量上發(fā)生改變，成為對人體無益或有損的體液，稱為異常體液。在體內外各種因素的作用下，人體

4、內膽質體液的量增加，功能改變，在機體基礎“熱”的作用下“燃燒”最終形成異常黒膽質，是許多疾病維吾爾醫(yī)學病理生理上所共有的特性。治療上主要采用異常黒膽質成熟劑（Abnormal Savda Munziq，ASMq）進行調整。ASMq在防治部分腫瘤、糖尿病、高血壓等方面均取得了一定效果。體外研究顯示ASMq具有抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡等作用。研究表明皮膚增生性瘢痕是由于成纖維細胞過度增殖以及細胞外基質膠原過度沉積所引起，又被稱為“皮膚

5、成纖維細胞良性腫瘤”。本研究在傳統(tǒng)維醫(yī)理論指導下提出科學假設：皮膚增生性瘢痕是異常黒膽質體液在皮膚的局部沉積所致，是全身異常黒膽質體液的局部表現。本研究擬通過兔耳增生性瘢痕動物模型以及體外人增生性瘢痕成纖維細胞培養(yǎng)實驗，通過采用不同濃度 ASMq干預研究，來檢驗假設，并進一步探討其細胞與分子機制。
　　研究表明，增生性瘢痕是由于成纖維細胞過度增殖以及細胞外基質膠原過度沉積所引起，其中TGF-β是導致增生性瘢痕形成的重要細胞因子，它

6、主要通過TGF-β/Smad信號通路參與調節(jié)成纖維細胞的增殖，凋亡，遷移和膠原代謝。TGF-β能同時觸發(fā)兩個可以對抗Smad蛋白介導的正反饋調節(jié)機制，其中就是快速激活Smad7啟動子，誘導Smad7基因表達，通過Smad7競爭性的占據TGF-βI型受體，抑制受體的蛋白激酶R-TGF-β的磷酸化而阻斷信號傳導，最后誘發(fā)它能促進細胞外基質在傷口沉積，并能促進纖維化，促使形成增生性瘢痕。
　　由于增生性瘢痕是成纖維細胞過度增殖和細胞外膠

7、原機制過度沉積而引起，因此抑制成纖維細胞增殖、抑制其膠原表達是防治增生性瘢痕的基礎。在細胞水平上，通過抑制細胞活性從而抑制成纖維細胞增殖、促進細胞凋亡可以減少瘢痕內成纖維細胞數量，可以在一定程度上防治增生性瘢痕；在細胞超微結構中，改變細胞內內質網、核糖體、線粒體等與膠原表達關系密切的亞細胞器活性可以在一定程度上具有減少瘢痕膠原的沉積的作用；在蛋白分子水平上，由于TGF-β/Smad信號通路是膠原產生的主要通路之一，且TGFβ1是促進細胞

8、增殖的重要因子之一，因此通過減少TGFβ1的表達、增加Smad7的表達可以防治增生性瘢痕的發(fā)生和發(fā)展。
　　目的：
　　通過體內體外實驗初步探討維藥ASMq對增生性瘢痕的影響及其作用機制，為臨床采用維醫(yī)維藥理論防治增生性瘢痕提供實驗和理論依據。
　　方法：
　　本研究采用兔耳瘢痕動物模型、體外增生性瘢痕成纖維細胞培養(yǎng)等途徑，分別從組織學、細胞學以及分子生物學水平，探討維藥 ASMq對增生性瘢痕的影響及其作用機制。

9、第一部分，體內實驗部分，灌胃給予維藥ASMq對兔耳增生性瘢痕影響的實驗研究。20只新西蘭大耳白兔采用隨機數字表法隨機分為4組，即空白對照組（生理鹽水）三個實驗組分別為：（ASMq400 mg/kg)、（ASMq800 mg/kg）、（ASMq1200 mg/kg），每組5只。在創(chuàng)面形成后第45天（預實驗表明此時瘢痕增生達到峰值），分別取材后進行各項指標測定，備好切片后進行四項實驗實施。
　?。?）通過計算瘢痕增生指數（Hypert

10、rophic Indes, HI），與空白對照組相比，從而明確各實驗組ASMq對兔耳增生性瘢痕有無影響。
　?。?）通過對各組創(chuàng)面范圍內組織切片行HE染色，觀察各組兔耳瘢痕膠原排列以及成纖維細胞密度等情況，進一步明確ASMq對兔耳增生性瘢痕膠原增生以及成纖維細胞增殖的影響。
　?。?）通過對各組創(chuàng)面范圍內組織行 Masson染色，觀察各組膠原排列以及膠原密度，通過采用單因素方差分析分析多組間膠原面密度，通過兩兩比較 q檢驗，

11、明確各組間膠原面密度有無差異。
　?。?）通過對兔耳創(chuàng)面范圍內組織標本通過透射電鏡觀察組織超微結構（包括原膠原纖維、線粒體、內質網等細胞亞結構），通過與空白對照組相比較分析，初步在超微結構層面進一步觀察不同濃度維藥ASMq對兔耳增生性瘢痕的影響機制。第二部分，體外實驗，通過體外分離培養(yǎng)人增生性瘢痕來源成纖維細胞，分四組（1個空白對照組，3個實驗組）：空白對照組，低濃度ASMq組（0.1mg/ml），中濃度ASMq組（0.4mg/m

12、l），高濃度ASMq組（0.7mg/ml）。對各組在相應時間點收集標本進行檢測：
　?。?）通過CCK-8方法，采用酶標儀檢測 ASMq對成纖維細胞體外增殖有無影響。
　?。?）采用細胞凋亡分析試劑盒通過流式細胞分析儀行細胞凋亡檢測，擬明確不同濃度 ASMq對成纖維細胞凋亡的影響。
　　（3）采用細胞周期檢測試劑盒，通過流式細胞術分析ASMq對成纖維細胞細胞周期的影響，擬明確ASMq阻斷細胞增殖周期的具體時間點。

13、>　　（4）通過細胞劃痕遷移實驗觀察成纖維細胞遷移能力，擬明確不同濃度ASMq對成纖維細胞遷移能力有無影響。
　?。?）通過透射電鏡觀察成纖維細胞合成原膠原能力以及內質網、核糖體、細胞核、線粒體等細胞亞結構情況，擬明進一步分析明確不同濃度 ASMq對成纖維細胞表達膠原以及細胞凋亡、增殖的機制。第三部分，采用RT-PCR方法和免疫印跡等方法基于TGFβ/Smad通路分析ASMq對增生性瘢痕來源成纖維細胞細胞增殖、膠原表達影響的分子機

14、制。擬明確不同濃度 ASMq對增生性瘢痕來源成纖維細胞細胞增殖、膠原表達的分子機制。結果：第一部分，體內兔耳增生性瘢痕動物模型實驗結果表明，灌胃給藥ASMq可以在一定程度上抑制增生性瘢痕的發(fā)生發(fā)展，且在一定濃度范圍內具有濃度梯度依賴性。
　?。?）大體觀察結果，增生性瘢痕的厚度隨著ASMq的濃度逐漸增大，其厚度逐漸減小，硬度逐漸軟化，體積逐漸減小，趨于平復，顏色逐漸變淡。
　?。?）計算瘢痕增生指數結果，與空白組（3.87±

15、0.22）對比，實驗各組分別為（3.38±0.34）、（2.63±0.15）、（1.72±0.12）增生性指數（HI）隨著ASMq的濃度逐漸增加而降低（p<0.05）。
　?。?）通過HE染色在1200 mg/kg濃度維藥ASMq灌胃后對瘢痕增生的成纖維細胞密度觀察結果，與空白組（4022.5±189.3)相比，實驗組(3541.4±206.6)的顯示瘢痕增生不明顯，成纖維細胞數量及密度減少（p<0.05）。
　?。?）通過

16、Masson染色在1200 mg/kg濃度維藥ASMq灌胃后對瘢痕增生的膠原纖維情況觀察結果，與空白組（42.25±2.58）相比，實驗組(23.55±1.28)的增生性瘢痕膠原纖維面密度明顯減少（p<0.05）。
　　（5）通過透射電鏡觀察不同濃度的ASMq對增生性瘢痕成纖維細胞的超微結構觀察結果；與空白組對比，隨著實驗組濃度的遞增成纖維細胞密度和膠原纖維面密度逐漸減少。第二部分，體外增生性瘢痕來源成纖維細胞干預實驗結果表明，在

17、一定濃度范圍內ASMq具有抑制成纖維細胞增殖、促進細胞凋亡的作用；細胞超微結構分析結果顯示ASMq具有抑制成纖維細胞原膠原合成，抑制細胞亞結構（如內質網、核糖體、線粒體等）活性，促進細胞凋亡等作用。生物學特性的影響。
　　（1）體外細胞培養(yǎng)原代和傳代及細胞凍存和復蘇情況結果，成纖維細胞界限清楚，胞體較大，呈棱形或不規(guī)則三角形，細胞質向外伸出兩三個長短不同的突起，胞漿豐富、胞膜邊界清晰、核仁多以成雙出現大小均等。
　　（2）用

18、CCK-8法檢測各組 HSFs增殖活性結果，與空白對照組相比，不同濃度ASMq組以及陽性對照組5-Fu組的HSFs增值活性明顯降低，其差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　?。?）用流式細胞技術檢測各組 HSFs細胞凋亡結果，與空白對照組凋亡率為2.2％±0.59%，不同濃度ASMq實驗組凋亡率分別為14.1%±3.87%，23.5%±3.22%，38.8%±3.14%,43.7%±2.58%；ASMq組凋亡率明顯高于對照組，且

19、凋亡率隨ASMq濃度增加呈遞增趨勢。
　?。?）ASMq對HSFs細胞周期的影響結果，與空白對照組比較，不同濃度ASMq組HSFs在G2/M期細胞比例呈不同程度升高，具有濃度依賴性，即在0.1~1.0mg/ml濃度間，隨著ASMq濃度增加，G2/M期細胞比例從13.1%增加到29.5%，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　（5）ASMq干預增生性瘢痕來源的成纖維細胞遷移實驗結果，與空白組相比，實驗組分別在0h、24h、

20、48h后，增生性瘢痕的成纖維細胞遷移能力隨著時間的延長而逐漸減弱（p<0.05）。
　?。?） ASMq對HSFs超微結構的影響結果，從低倍和高倍鏡觀察到：0.4mg/ml組的成纖維細胞的細胞核消失；0.7mg/ml組成纖維細胞膜出現收縮；1mg/ml組成纖維細胞出現凋亡小體相對空白組。第三部分，通過體外對不同濃度ASMq干預后的增生性瘢痕來源成纖維細胞基于TGFβ/Smad通路分析，結果顯示ASMq可以抑制TGFβ1的表達，促進

21、抑制型Smad7的表達。在分子生物水平方面，通過RT-PCR的檢測方法和western-blot檢測方法。
　?。?）ASMq對成纖維細胞TGF-β1mRNA表達的影響結果，與空白組對比，AMSq隨著藥物濃度的增加，TGF-β1mRNA表達量減少(P<0.05)。
　?。?）ASMq對成纖維細胞Smad7mRNA表達的影響結果，與空白組對比，ASMq隨著藥物濃度的增加Smad7mRNA表達量增加(P<0.05)。
　　

22、（3）ASMq對成纖維細胞TGF-β1蛋白表達的影響結果，與空白組對比，ASMq隨著藥物濃度的增加，TGF-β1蛋白表達量減少(P<0.05)。
　?。?）ASMq對成纖維細胞Smad7蛋白表達的影響結果，與空白組對比，ASMq隨著藥物濃度的增加Smad7蛋白表達量增加(P<0.05)。
　　結論：
　　灌胃給藥ASMq可以在一定程度上抑制兔耳增生性瘢痕的發(fā)生發(fā)展，且在一定濃度范圍內具有濃度梯度依賴性，其通過抑制膠原合

23、成和成纖維細胞增殖途徑發(fā)揮作用。在一定濃度范圍內，ASMq具有抑制人增生性瘢痕來源成纖維細胞增殖、促進細胞凋亡的作用；細胞超微結構分析結果顯示ASMq具有抑制成纖維細胞原膠原合成，抑制細胞亞結構（如內質網、核糖體、線粒體等）活性，促進細胞凋亡等作用。ASMq可以抑制人增生性瘢痕來源成纖維細胞TGF-β1的表達，促進抑制型Smad7的表達。綜上表明ASMq可以基于TGFβ/Smad通路抑制成纖維細胞增殖、促進細胞凋亡以及抑制膠原表達，從而