椎間盤髓核突出與交感性神經(jīng)行為異常的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、選題的背景及目的:
　　隨著老齡化社會(huì)的到來，出現(xiàn)腰腿痛癥狀的患者逐漸增加，其中腰椎間盤突出是導(dǎo)致腰腿痛的重要原因之一。雖然目前有機(jī)械壓迫性因素、生物化學(xué)活性物質(zhì)刺激、自身免疫炎癥反應(yīng)等機(jī)制學(xué)說用于闡明腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)腰腿疼痛癥狀的發(fā)病機(jī)制，但LDH肢體疼痛癥狀的具體發(fā)生機(jī)制仍不明確。
　　交感神經(jīng)是人體自主神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，大部分交感神經(jīng)節(jié)后纖維為腎上腺素能纖維，

2、以去甲腎上腺素為遞質(zhì)。有研究顯示通過采用切斷某些特定部位的交感神經(jīng)纖維可以明顯緩解某些神經(jīng)病理性疼痛，采用對交感神經(jīng)阻滯的方法也能緩解因周圍神經(jīng)損傷而引起的神經(jīng)性疼痛癥狀。交感芽生是一種交感神經(jīng)節(jié)后纖維在周圍神經(jīng)損傷后向DRG內(nèi)部感覺神經(jīng)元生長、包繞的現(xiàn)象。大量研究發(fā)現(xiàn)背根神經(jīng)節(jié)(Dorsalroot ganglion，DRG)內(nèi)的交感神經(jīng)芽生現(xiàn)象在神經(jīng)病理性疼痛中可能發(fā)揮著重要作用。在通常情況下，DRG內(nèi)的交感神經(jīng)纖維僅分布于DRG內(nèi)

3、穿行的血管表面，DRG內(nèi)的感覺神經(jīng)元對交感神經(jīng)的興奮刺激也不敏感。但有學(xué)者在周圍神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)交感神經(jīng)傳出纖維會(huì)向DRG內(nèi)延伸生長，廣泛包繞感覺神經(jīng)元，并可形成特殊的“籃狀結(jié)構(gòu)”，具有“籃狀結(jié)構(gòu)”的感覺神經(jīng)元除具有較高的自發(fā)性放電頻率外，引起神經(jīng)元放電所需的刺激閾值也出現(xiàn)降低。
　　臨床上有部分椎間盤突出癥患者會(huì)出現(xiàn)一些交感性神經(jīng)異常相關(guān)癥狀，如出現(xiàn)肢體發(fā)涼，多汗或無汗等等，然而具體原因卻不清楚。大量研究表明DRG交感神

4、經(jīng)芽生現(xiàn)象同神經(jīng)病理性疼痛之間有著密切關(guān)系。椎間盤突出癥患者可以出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)痛癥狀，那么椎間盤突出癥與DRG交感神經(jīng)芽生之間是否也存在著聯(lián)系，交感神經(jīng)芽生是否也是導(dǎo)致椎間盤突出癥疼痛癥狀的因素之一呢？目前認(rèn)為椎間盤髓核所引起的免疫炎癥反應(yīng)可能是導(dǎo)致腰椎間盤突出癥神經(jīng)病理性疼痛的重要原因之一，因此本研究旨在初步探尋單純椎間盤髓核突出與DRG內(nèi)交感神經(jīng)的聯(lián)系，及其對疼痛所產(chǎn)生的作用，以期進(jìn)一步闡明椎間盤突出癥的發(fā)病機(jī)制，為椎間盤突出癥神經(jīng)

5、病理性疼痛的臨床診治提供新的研究切入點(diǎn)。
　　研究方法:
　　首先，我們通過手術(shù)操作制作大鼠腰椎間盤髓核突出疼痛模型，其后觀察大鼠行為學(xué)改變，并通過檢測大鼠后足機(jī)械痛閾和熱痛閾的方法評估大鼠痛閾變化。然后，我們?nèi)〕瞿Ｐ痛笫蟮腄RG進(jìn)行切片和免疫組化（immunohistochemistry，IHC）染色，觀察DRG內(nèi)交感神經(jīng)纖維形態(tài)和分布上的變化。最后，我們通過采集DRG切片的IHC染色照片，應(yīng)用圖像分析軟件對切片內(nèi)交感神經(jīng)

6、纖維數(shù)量進(jìn)行評估測定，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　一、腰椎間盤髓核突出大鼠模型的制備
　　1.動(dòng)物分組:
　　本課題采用SD大鼠制作動(dòng)物模型，大鼠價(jià)格低廉，純合性也相對較好，并且基因也較為接近人類，是目前國際上比較常用的椎間盤突出動(dòng)物模型。本課題共采用110只雄性SD大鼠，體重約為250-300g。隨機(jī)抽取其中10只作為空白對照組，另外100只采用數(shù)字表法隨機(jī)分為髓核(nucleus pulposus，NP)處

7、理組（手術(shù)組）和非髓核處理組（假手術(shù)組），按照術(shù)后2、5、7、14、20天五個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，每組每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)10只進(jìn)行分組。
　　2.制備方法:
　　各組大鼠均用3％濃度的戊巴比妥鈉按50mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉。手術(shù)組將大鼠尾部近端切開，暴露尾椎間盤并刺破纖維環(huán)使髓核突出，用刮匙取出髓核后縫合創(chuàng)口。于大鼠背側(cè)做正中切口，剝離椎旁肌肉，切除左側(cè)椎板及部分椎間關(guān)節(jié)暴露L5左側(cè)背根神經(jīng)節(jié)，將自體髓核放置于背根神經(jīng)節(jié)表面后縫

8、合切口。假手術(shù)組僅切除L5左側(cè)椎板，并不取出、放置尾部椎間盤髓核。
　　二、大鼠痛閾檢測
　　1.大鼠機(jī)械性痛閾檢測:
　　利用Von Frey纖維絲檢測各組大鼠模型各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)后足的機(jī)械性痛閾變化情況。
　　2.大鼠熱痛閾檢測:
　　利用熱輻射痛覺測量儀檢測各組大鼠模型各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)后足的熱痛閾變化情況。
　　三、大鼠DRG內(nèi)交感神經(jīng)形態(tài)和數(shù)量變化
　　1.大鼠灌注固定及標(biāo)本取材:
　　將

9、正常組、手術(shù)組及假手術(shù)組大鼠在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)痛閾測試進(jìn)行完畢后分別進(jìn)行心室灌注固定處死。用約300ml的4％多聚甲醛行左心室灌注。沿大鼠背側(cè)原縱行切口切開，暴露左側(cè)L5背根神經(jīng)節(jié)并取出。脫水后固定后將背根神經(jīng)節(jié)用冰凍切片機(jī)切片，切片厚度約30um。
　　2.切片免疫組化染色染色及觀察:
　　DRG切片分別在1∶200稀釋的TH抗體及生物素化的二抗中孵育，并使用VECTASTAIN(@)ABC試劑孵育切片。在IHC染色過程中使用T

10、riton-X100以保證更好地促使抗體與抗原相結(jié)合。DAB顯色，脫水風(fēng)干，中性樹膠封片后放置于光學(xué)顯微鏡下觀察。
　　3.交感神經(jīng)纖維含量測定
　　隨機(jī)抽取每個(gè)DRG切片中的三分之一于顯微鏡下觀察拍照，并通過圖像分析軟件ImageJ1.47v對DRG中的交感神經(jīng)纖維含量進(jìn)行測量。通過將圖像分析軟件測得的交感神經(jīng)纖維長度總和除以測量面積計(jì)算交感神經(jīng)密度的方法來估測DRG內(nèi)交感神經(jīng)纖維含量。
　　四、大鼠DRG內(nèi)NGF及

11、BDNF含量變化
　　1.大鼠模型制備及分組:
　　雄性健康SD大鼠30只分為手術(shù)組(NP處理組)、假手術(shù)組（非NP處理組）和正常組。采取隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分組的方法對各組大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，每個(gè)組10只。按照前述方法建立L4及L5雙節(jié)段NP突出模型。
　　2.DRG樣本取材:
　　術(shù)后7天，各組大鼠處死。手術(shù)取出術(shù)側(cè)L4及L5兩個(gè)節(jié)段DRG，裝入容器內(nèi)，標(biāo)記后-70℃冰箱內(nèi)保存。
　　3.ELISA測定樣本NG

12、F及BDNF含量:
　　采用酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）測定正常組大鼠、NP處理組大鼠及非NP處理組大鼠DRG內(nèi)NGF及BDNF含量并統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　一、大鼠模型后足機(jī)械性痛閾和熱痛閾降低
　　1.手術(shù)組及假手術(shù)組大鼠術(shù)后1周內(nèi)有明顯行為學(xué)改變，大鼠出現(xiàn)術(shù)側(cè)后足抬高、避免著地負(fù)重及舔撫術(shù)側(cè)后足現(xiàn)象，NP處理組大鼠表現(xiàn)得更為明顯、

13、頻繁。術(shù)后5天內(nèi)，NP處理組及假手術(shù)組術(shù)側(cè)后足機(jī)械性痛閾低于正常組大鼠，NP處理組大鼠在術(shù)后7、14、20天的機(jī)械性痛閾水平低于假手術(shù)組和正常組(P＜0.05)。
　　2.大鼠術(shù)后5天內(nèi)，NP處理組及假手術(shù)組術(shù)側(cè)后足的熱痛閾值低于正常組大鼠。NP處理組大鼠于術(shù)后7、14、20天熱痛閾水平明顯低于假手術(shù)組和正常組(P＜0.01)。
　　二、大鼠模型DRG內(nèi)交感神經(jīng)向內(nèi)部生長
　　1.正常組大鼠背根神經(jīng)節(jié)切片經(jīng)免疫組化染色

14、后，通過在顯微鏡下觀察，僅可見少量棕染的交感神經(jīng)纖維，且所見交感神經(jīng)纖維較為細(xì)小，并多分布于背根神經(jīng)節(jié)外周部位。
　　2.髓核處理組大鼠背根神經(jīng)節(jié)切片經(jīng)免疫組化染色后，通過在顯微鏡下觀察，可見棕染的交感神經(jīng)纖維數(shù)量增粗、增多，并向背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)部感覺神經(jīng)元之間伸入生長，大量感覺神經(jīng)元被交感神經(jīng)纖維所包繞。
　　三、大鼠模型DRG內(nèi)交感神經(jīng)數(shù)量明顯增加
　　采集的背根神經(jīng)節(jié)切片照片通過應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行量化分

15、析后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)髓核(NP)移植處理的大鼠背根神經(jīng)節(jié)切片內(nèi)交感神經(jīng)纖維數(shù)量要顯著高于正常組和非NP處理組DRG內(nèi)所含交感神經(jīng)纖維數(shù)量。
　　四、大鼠DRG內(nèi)NGF及BDNF含量變化
　　結(jié)果顯示術(shù)后7天，手術(shù)組大鼠DRG內(nèi)NGF含量明顯高于正常組和假手術(shù)組。術(shù)后7天，手術(shù)組大鼠DRG內(nèi)BDNF含量低于正常組和假手術(shù)組。
　　結(jié)論:
　　一、在單純自體椎間盤髓核刺激DRG的情況下，可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)痛性行為異常及術(shù)側(cè)肢體痛