Laminin蛋白對UBM上BMSCs增殖及其向平滑肌細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的：
　　壓力性尿失禁(Stress urinary incontinence，SUI)是老年婦女的常見臨床疾病，在老年婦女中的發(fā)病率高達(dá)27.6％，嚴(yán)重影響了廣大婦女生活質(zhì)量。SUI的發(fā)病機制與女性盆底結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān)，目前已經(jīng)得到婦產(chǎn)科學(xué)界的重視。
　　手術(shù)治療是SUI的常用治療方法，懸吊術(shù)已成為SUI治療的一線手術(shù)方式。目前臨床運用的吊帶材料包括合成材料和生物材料。合成材料因其具有組織侵蝕性強、瘢痕形成等難以克服的缺

2、陷，不利于臨床廣泛推廣。而經(jīng)脫細(xì)胞處理的生物材料因保留了組織的完整性，且免疫源性低，已被廣泛應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)，脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)（Urinary bladder matrix，UBM）是生物材料的一種，初步研究表明其在SUI的治療中具有一定的潛能，但面臨的最大問題是降解周期短，從而導(dǎo)致SUI復(fù)發(fā)。一些學(xué)者提出將干細(xì)胞種植于生物材料上進行替代治療可能是SUI的有效治療手段，然而卻存在著負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow me

3、senchymal stem cells，BMSCs)的UBM存在著BMSCs增殖率低以及向平滑肌細(xì)胞分化程度低的缺點，因此，如何提高UBM上BMSCs的增殖率及向平滑肌細(xì)胞分化率是目前亟待解決的熱點問題。
　　已有研究報道，Laminin蛋白通過其LG端功能域與BMSCs表面的整合素受體相結(jié)合從而促進BMSCs的增殖，并且有報道稱將Laminin蛋白加入到培養(yǎng)人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，作為體外擴增人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的一種常

4、用方法。同時，Laminin蛋白可促進BMSCs向成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等方向分化。而Laminin蛋白不僅是構(gòu)成UBM材料基底層的基本結(jié)構(gòu)，而且是UBM基底層最重要的功能蛋白。但是UBM上的Laminin蛋白是否具有促進負(fù)載BMSCs增殖及向平滑肌細(xì)胞分化的功能尚不明確。結(jié)合我們的前期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過脫細(xì)胞處理后的UBM上Laminin蛋白的LG域在基底層面處于向外的游離狀態(tài)，而通過交聯(lián)劑交聯(lián)后可使部分LG域相互融合而喪失功能，由此進一步證明L

5、aminin蛋白的LG功能域在BMSCs增殖、遷移以及分化中的作用。因此，我們推測UBM上的Laminin蛋白也具有促進BMSCs增殖及向平滑肌細(xì)胞分化的功能，探討UBM上Laminin蛋白的這一功能，對現(xiàn)有的UBM進行改善，從而為SUI新型生物材料的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.1 BMSCs的制備
　　采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)3-4周雌性SD大鼠的BMSCs，運用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測BMSCs的免疫表型，進行

6、干細(xì)胞鑒定，將P3代BMSCs作為種子細(xì)胞。
　　1.2 UBM的制備
　　采用機械分離和酶消化等方法對新鮮豬膀胱進行處理，達(dá)到脫細(xì)胞目的，進行冷凍干燥、消毒滅菌后密封保存，作為組織工程材料。
　　1.3 UBM復(fù)合材料的制備
　　采用蛋白孵育法，制備UBM+Laminin材料以及UBM+Anti-Laminin材料，進行免疫組化學(xué)檢測Laminin蛋白在復(fù)合材料組及單純UBM組的表達(dá)情況。
　　1.4.L

7、DH檢測BMSCs活性
　　取P3代BMSCs，按3000/孔接種于96孔板，實驗組為UBM+Laminin組、UBM組和UBM+Anti-Laminin材料，每孔加120μl的細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)置5個復(fù)孔，置于37℃，5％ CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，隔日換液，并觀察培養(yǎng)液有無渾濁。分別取培養(yǎng)1d、3d、5d、7d、9d細(xì)胞上清液行LDH檢測。
　　1.5 CKK8檢測BMSCs增殖
　　實驗組分為3組，分別為:UBM+

8、Laminin組、UBM組和UBM+Anti-Laminin組。每組5個附孔，每孔3000個BMSCs接種于96孔板，于培養(yǎng)1、3、5、7、9、12、14天的組織行CCK8檢測。
　　1.6 HE染色觀察BMSCs遷移情況
　　將P3代BMSCs(1×105/cm2)接種于三組材料上，定期觀察培養(yǎng)液有無渾濁，于接種3d、5d、7d、14d的組織行HE染色，定向觀察BMSCs在不同材料上的遷移情況。
　　1.7免疫組化學(xué)

9、技術(shù)檢測BMSCs向SMC分化情況
　　取接種第14天的組織行免疫學(xué)檢測BMSCs表達(dá)α-SMA情況，觀察BMSCs向平滑肌細(xì)胞分化情況。
　　1.8統(tǒng)計學(xué)分析
　　統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。
　　結(jié)果：
　　2.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　顯微鏡下觀察原代分離的BMSCs呈漩渦狀、貼壁生長，雜細(xì)胞較多，培養(yǎng)1周后細(xì)胞融合達(dá)90

10、％。傳代后細(xì)胞較均一，形態(tài)規(guī)則，呈長梭型，增殖快。流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測BMSCs表達(dá)中胚層來源分子CD29，陽性率為98.0％，表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特征分子CD31，陽性率為4.56％，表達(dá)造血干細(xì)胞系特征分子CD34，陽性率為3.30％，符合BMSCs的特征。
　　2.2 UBM的制備
　　肉眼觀察UBM材料呈致密均勻的半透明的膜狀組織，顯微觀察UBM由致密均勻的膠原纖維和基質(zhì)組成，掃描電鏡觀察UBM的膠原分布致密均勻，纖維完整，未

11、見細(xì)胞殘留。
　　2.3 UBM復(fù)合材料的制備
　　免疫組化學(xué)檢測UBM材料表明Laminin蛋白主要分布于基底層面，部分位于非基底層，Laminin蛋白孵化UBM組Laminin蛋白表達(dá)明顯增高，Anti-Laminin組表達(dá)明顯下降，表明材料上部分蛋白可以被抗體封閉。
　　2.4三組材料負(fù)載BMSCs的活性
　　共培養(yǎng)5天，UBM+Anti-Laminin組LDH檢測值明顯升高，表明死亡細(xì)胞數(shù)目增多。三組材料

12、上BMSCs的LDH值均在培養(yǎng)第7天達(dá)高峰，7-9天LDH曲線呈平行趨勢。UBM+Anti-Laminin組LDH檢測值明顯高于其余兩組，而UBM+Laminin與UBM無明顯的差異。
　　2.5三組材料BMSCs生長情況
　　運用CCK8檢測方法表明三組材料均能支持BMSCs生長，三組細(xì)胞生長曲線類似，培養(yǎng)1周內(nèi)，細(xì)胞處于潛伏適應(yīng)期，培養(yǎng)1周后細(xì)胞呈對數(shù)生長，培養(yǎng)9天后細(xì)胞生長基本到達(dá)平臺，UBM+Laminin組對BMS

13、Cs增殖有顯著促進作用。
　　2.6 HE染色觀察BMSCs遷移情況
　　取共培養(yǎng)3、5、7、14天組織行HE染色觀察，三組材料均能支持細(xì)胞粘附生長，培養(yǎng)3天發(fā)現(xiàn)UBM+Laminin組材料表面有多層細(xì)胞附著，細(xì)胞密度明顯高于其他兩組，隨接種時間延長，可見細(xì)胞明顯向深層遷移，培養(yǎng)14天，部分細(xì)胞到達(dá)材料基底層，且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞核拉伸延長。UBM組BMSCs主要集中在材料表面生長，部分向深層遷移，而UBM+Anti-L

14、aminin組共培養(yǎng)期間細(xì)胞依舊粘附在材料表面，僅個別細(xì)胞向深層遷移。
　　2.7免疫組化學(xué)技術(shù)檢測BMSCs向SMC分化情況
　　共培養(yǎng)14天，免疫組化學(xué)檢測BMSCs中平滑肌標(biāo)記性蛋白α-SMA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)UBM+Laminin組表達(dá)強陽性，UBM組呈弱陽性，而UBM+Anti-Laminin組則表達(dá)陰性。
　　結(jié)論：
　　1.分離培養(yǎng)了純度較高的BMSCs;
　　2.成功制備了UBM材料;
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