轉(zhuǎn)VEGF內(nèi)皮細(xì)胞株的建立及其對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化疾病(AS)屬于心血管疾病中的一個(gè)大類，它嚴(yán)重影響著人們的健康。冠狀動(dòng)脈支架植入已是治療該疾病的重要手段。但是支架的植入會(huì)再次引發(fā)支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生，目前，抑制血管支架再狹窄的主要途徑是采用藥物洗脫性支架，藥物洗脫支架明顯的降低了再狹窄發(fā)生的概率，但再狹窄的問題仍然無法避免，其原因在于藥物在阻斷血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cells，VSMCs)增生的同時(shí)也抑制了內(nèi)皮細(xì)胞(Endotheli

2、al Cells，ECs)的增殖，進(jìn)一步延緩了手術(shù)后的再內(nèi)皮化進(jìn)程，從而導(dǎo)致再狹窄。
　　 血管ECs和VSMCs之間的相互作用是不同心血管疾病發(fā)展的基礎(chǔ)，內(nèi)皮層血管壁內(nèi)膜在植入支架的過程中很容易被損壞。血管壁損傷后，VSMCs從靜態(tài)的收縮表型分化為有利于遷移，增殖，最終導(dǎo)致血管再狹窄。因此加速血管內(nèi)皮化是防止血管再狹窄的可行性措施。
　　 本文通過構(gòu)建組織工程細(xì)胞，用作支架種子細(xì)胞，以期種植到支架表面后能以加速ECs的

3、增殖、遷移，促進(jìn)血管內(nèi)皮化，以此來抑制VSMCs的增殖，及防止支架再狹窄的發(fā)生。同時(shí)利用Transwell共培養(yǎng)模型與大鼠VSMCs進(jìn)行共培養(yǎng)，從而研究聯(lián)合培養(yǎng)調(diào)節(jié)下的穩(wěn)定表達(dá)VEGF121的ECs對(duì)VSMCs增殖的影響。全文研究結(jié)果如下：
　　 ①利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建2種pSilencer3.1-VEGF121-shRNA真核干擾表達(dá)載體和一種陰性干擾載體，通過潮霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，同時(shí)復(fù)蘇本實(shí)驗(yàn)室保存的可以穩(wěn)定表達(dá)的p

4、IRES2-EGFP-VEGF過表達(dá)ECs，通過Western blot及RT-PCR檢測(cè)種子細(xì)胞VEGF蛋白和VEGF基因的表達(dá)，同時(shí)篩選出抑制效率最高的pSilencer3.1-VEGF121-shRNA2表達(dá)質(zhì)粒，結(jié)果證實(shí)具有穩(wěn)定表達(dá)不同水平VEGF的ECs構(gòu)建成功。
　　 ②通過MTT法驗(yàn)證到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VEGF基因的ECs的增殖速度明顯比對(duì)照組和VEGF干擾組快，且細(xì)胞的血管形成能力和遷移能力都明顯高于對(duì)照組和干擾的細(xì)胞，

5、轉(zhuǎn)VEGF基因的細(xì)胞的NO分泌量較對(duì)照組與干擾組明顯增加，并采用FITC-Phalloidin對(duì)ECs的骨架進(jìn)行染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF干擾組的細(xì)胞質(zhì)F-肌動(dòng)蛋白絲和肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維減少，細(xì)胞外圍邊緣的F-肌動(dòng)蛋白也明顯減少，說明血管內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)VEGF可以促進(jìn)細(xì)胞骨架的形成。
　　 ③采用貼壁法成功培養(yǎng)并鑒定出原代大鼠平滑肌細(xì)胞，同時(shí)利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)將ECs與大鼠的VSMCs進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)下穩(wěn)定表達(dá)