HCMV感染內(nèi)皮細胞來源的外泌體對血管平滑肌細胞功能影響的初步研究.pdf

1、目的:驗證超速離心法、蔗糖梯度離心法提取HCMV感染的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）上清中外泌體(exosomes)的效率。分析來源于HCMV感染HUVEC來源的exo so mes中是否含有差異表達的miRNAs，進一步觀察該exosomes能否與人主動脈平滑肌細胞(human aortic smoothmuscle cell，HASMC)通信并影響其遷移功

2、能。
　　方法:(1)選用HCMV-AD169實驗室株及HUVEC原代細胞株，體外模擬HCMV的活動性感染狀態(tài)。實驗共分3組:①實驗組，吸附感染法接種5 TCID50活性HCMV-AD169;②陰性對照組，吸附感染法接種等量經(jīng)紫外線(ultraviolet，UV)滅活的HCMV-AD169;③空白對照組，吸附感染法相同步驟模擬接種同等體積DMEM液。當(dāng)實驗組細胞病變效應(yīng)(Cytopathic Effect，CPE)達到約90％時，

3、3組同時更換培養(yǎng)液，并繼續(xù)培養(yǎng)2～3天后同時收集細胞上清。采用超速離心法及蔗糖梯度離心法提取上清中exosomes。分別以透射電鏡驗證exosomes形態(tài)、直徑，western-blot驗證exosomes膜表面標志蛋白CD9。(2) EXO-quick試劑盒法提取3組上清中的exosomes，用Illumina HiSeqTM2500平臺對其miRNAs進行測序，并分析是否具有差異表達的miRNAs。(3)體外培養(yǎng)HASMC，分別與3

4、組離心提取的exosomes共培養(yǎng)，以劃痕實驗及transwell實驗檢測exosomes與HASMC的通訊作用及對其遷移能力的影響。
　　結(jié)果:(1)超速離心、蔗糖梯度離心所得粒子透射電鏡下檢測顯示，粒子直徑處于30～100 nm間且具有典型“杯托”樣外觀。并且，Western blot檢測證實表達CD9膜蛋白。證實超速離心、蔗糖梯度離心所得粒子即為exosomes。(2)exosomes測序結(jié)果顯示:實驗組與空白對照組間共有2

5、8對miRNAs表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，實驗組與陰性對照組間共17對miRNAs表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，陰性對照組與空白對照組間僅3對miRNAs表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(fold chang＞2，p＜0.05)?；仡櫸墨I發(fā)現(xiàn)，部分差異表達miRNAs已被證實可能與心血管疾病有關(guān)，如miR-96、miR-3960、miR-221等。(3)與對照組相比，實驗組能顯著促進HASMC的遷移能力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);而陰性對