PFH-Fe3O4@PLGA多功能相變型高分子造影劑MRI-US雙模態(tài)顯像及光熱治療實驗研究.pdf

1、第一部分.載Fe3O4及液態(tài)氟碳多功能相變型高分子造影劑的制備及性能檢測
　　目的:以高分子材料聚乳酸-羥基乙酸（Poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA）為外殼，液態(tài)全氟己烷（Perfluorohexane,PFH）為內(nèi)核，超順磁性四氧化三鐵納米顆粒（Ferriferrous oxide,Fe3O4）分布于殼層中，制備一種磁性相變型多功能納米乳液造影劑（PFH/Fe3O4@PLGA），檢測其一般特性，并

2、通過體外實驗觀察其相變能力。
　　方法:采用單乳化法制備載Fe3O4同時包裹PFH的高分子PFH/Fe3O4@PLGA納米粒,另外分別制備單純載Fe3O4納米粒的Fe3O4@PLGA納米粒、單純包裹PFH的PFH@PLGA納米粒以及空白PLGA納米粒為實驗對照組。對其表面形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、粒徑、電位等一般特性進(jìn)行檢測；用原子吸收光譜法測量不同濃度PFH/Fe3O4@PLGA納米粒溶液中的Fe濃度。然后用升溫及近紅外光輻照兩種方法于體

3、外激發(fā)納米粒相變，并于顯微鏡下動態(tài)觀察整個PFH/Fe3O4@PLGA乳液發(fā)生相變的過程，探討促發(fā)其發(fā)生相變的可行性。
　　結(jié)果: PFH/Fe3O4@PLGA溶于雙蒸水后呈棕色乳液，光鏡及掃描電鏡下觀察PFH/Fe3O4@PLGA呈球形，形態(tài)規(guī)則，大小尚均勻，分散度好，表面尚光滑。透射電鏡觀察PFH/Fe3O4@PLGA呈殼核結(jié)構(gòu)，外面為高分子殼層，大量致密金屬Fe3O4顆粒較均勻分布于納米殼層結(jié)構(gòu)中，中心為液態(tài) PFH構(gòu)成的內(nèi)

4、核。Malvern激光粒徑儀檢測出PFH/Fe3O4@PLGA平均直徑為（347±61.83nm）nm， Zeta電位為(?25.2±7.25)mV。原子吸收光譜法測量不同濃度PFH/Fe3O4@PLGA納米粒溶液（2.5μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，80μg/mL，160μg/mL，320μg/mL，640μg/mL，280μg/mL）中的Fe濃度分別為0.64±0.09μg/mL，1.39

5、±0.09μg/mL，2.66±0.30μg/mL，5.378±0.68μg/mL，10.76±1.26μg/mL，21.49±0.75μg/mL，30.0±1.27μg/mL，55.55±1.24μg/mL，117.11±2.10μg/mL，247.30±1.68μg/mL。當(dāng)溫度升高至一定程度或近紅外光輻照，均可促發(fā)納米粒發(fā)生相變，顯微鏡下可見相變后產(chǎn)生的微泡。
　　結(jié)論:成功制備了PFH/Fe3O4@PLGA多功能納米乳液，

6、形態(tài)規(guī)則、呈球形，大小均勻，性質(zhì)穩(wěn)定的。該造影劑具有良好液氣相變能力及磁性能，具備超聲及磁共振成像的潛能，在升溫及近紅外光輻照的誘發(fā)下可促發(fā)相變，是一種多功能造影劑。
　　第二部分.PFH/Fe3O4@PLGA多功能相變型高分子造影劑增強超聲及核磁顯像實驗研究
　　目的:通過體內(nèi)外實驗觀察PFH/Fe3O4@PLGA增強磁共振成像的效果；并于體內(nèi)外實驗觀察PFH/Fe3O4@PLGA發(fā)生相變后對超聲顯影的增強效應(yīng)，初步探討其

7、增強顯像機制。
　　方法:制備體外核磁成像模型，應(yīng)用磁共振掃描儀對不同濃度的納米粒溶液行MR掃描測量其信號強度并用原子吸收光譜法測量各樣品中Fe濃度。體內(nèi)核磁顯影實驗，取裸鼠10只分成兩組分別經(jīng)尾靜脈注入空白PLGA及PFH/Fe3O4@PLGA納米溶液（濃度320μg/ml，體質(zhì)量1ml/kg），注射前后行MR平掃及增強掃描，分別測量注射前后肝實質(zhì)信號強度值的變化。體外超聲顯影實驗，將1mL PFH/Fe3O4@PLGA（320

8、μg/ml）納米溶液通過注射器注入透明橡膠微細(xì)管（內(nèi)徑約2mm），于體外用升溫及近紅外光輻照兩種方式促發(fā)PFH/Fe3O4@PLGA相變，觀察納米乳液相變后對超聲顯像的增強作用。體內(nèi)超聲顯影實驗，24只荷瘤裸鼠隨機分成四組,用注射器在每組裸鼠腫瘤部位皮下注射0.2 ml等濃度(320μg/mL)的相應(yīng)的納米溶液（I：PLGA，II：PFH@PLGA, III：Fe3O4@PLGA，IV：PFH/Fe3O4@PLGA），按摩1min。在近

9、紅外光下進(jìn)行輻照，觀察輻照過程腫瘤處超聲顯影的增強情況。
　　結(jié)果:在體外核磁共振T2*加權(quán)成像顯像中，不同濃度的PFH/Fe3O4@PLGA均表現(xiàn)出明顯負(fù)性增強顯像，且信號強度隨納米溶液內(nèi)Fe3O4濃度的升高而下降。體內(nèi)裸鼠肝臟MR成像顯示，注射PFH/Fe3O4@PLGA后，肝實質(zhì)信號強度顯著下降。體外超聲顯影實驗中，當(dāng)溫度升高超過50℃、或近紅外光輻照后，均能促進(jìn)PFH/Fe3O4@PLGA發(fā)生相變產(chǎn)生微泡，并在造影下可見明

10、顯的超聲增強顯影。體內(nèi)超聲顯影實驗中，近紅外光輻照后實驗組IV(PFH/Fe3O4@PLGA)在超聲對比增強模式下明顯增強超聲顯影，對照組(I-III)未見明顯顯影。
　　結(jié)論:PFH/Fe3O4@PLGA在體內(nèi)外均具有增強磁共振顯像的能力，且在升溫及近紅外光輻照時可以發(fā)生相變，從而增強超聲顯影，具備成為多模態(tài)影像學(xué)對比劑的潛能。
　　第三部分.近紅外光聯(lián)合PFH/Fe3O4@PLGA納米乳劑增效光熱治療實驗研究
　　

11、目的:體內(nèi)外實驗觀察近紅外光聯(lián)合PFH/Fe3O4@PLGA對腫瘤細(xì)胞及腫瘤組織的破壞作用，探討PFH/Fe3O4@PLGA對近紅外光熱消融的增效作用及實現(xiàn)光熱治療的機制，研究其作為集診斷與治療于一體的多功能造影劑的潛力及可行性。
　　方法:體外培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，設(shè)置不同分組來探究近紅外光輻照時間及距離的不同而引起的溫度變化及對細(xì)胞凋亡率的影響，通過細(xì)胞凋亡率得出最佳輻照時間及距離。另外以Fe3O4@PLGA、PFH@P

12、LGA、PLGA為對照，來驗證PFH/Fe3O4@PLGA對近紅外光熱消融體外腫瘤細(xì)胞的增效作用。建立裸鼠SKOV3人卵巢癌移植瘤模型36只，于腫瘤種植后20-30天，隨機分為6組：空白對照組（I），單純近紅外輻照組（II），PLGA聯(lián)合近紅外輻照組（III），PFH@PLGA聯(lián)合近紅外輻照組（IV），F(xiàn)e3O4@PLGA聯(lián)合近紅外輻照組（V），PFH/Fe3O4@PLGA聯(lián)合近紅外輻照組（VI）。分別于組III-VI荷瘤裸鼠腫瘤部位局

13、部注射0.2mL(320μg/mL)相應(yīng)的納米粒溶液，局部按摩1min。組II-VI裸鼠均接受紅外光輻照（波長0.78-2.8μm，時間12min，距離15cm），并且進(jìn)行兩次輻照。近紅外光輻照結(jié)束后24小時，取下裸鼠腫瘤組織，采集標(biāo)本行HE染色、普魯士藍(lán)染色、細(xì)胞增殖及凋亡檢測及透射電鏡觀察。
　　結(jié)果:由體外細(xì)胞的實驗結(jié)果可知，近紅外光輻照溫度隨著時間的延長而升高，隨著輻照距離的增加而下降，而輻照溫度越高，細(xì)胞凋亡率越高。從溫

14、度與凋亡率的關(guān)系中可得到較適宜的輻照距離為15cm，輻照時間為5min。體外實驗中對比不同的納米粒聯(lián)合近紅外光對腫瘤細(xì)胞凋亡率的不同影響，可驗證Fe3O4/PFH@PLGA對近紅外光熱消融體外腫瘤細(xì)胞起到明顯的增效作用。而體內(nèi)實驗中, HE染色顯示PFH/Fe3O4@PLGA聯(lián)合近紅外輻照組腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯破壞，細(xì)胞膜及核膜碎裂溶解。免疫組化檢測可見大量凋亡腫瘤細(xì)胞，其凋亡指數(shù)明顯高于其他各組，增殖指數(shù)卻明顯低于其他各組（P<0.05）

15、。電鏡觀察見部分腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞膜和核膜失去連續(xù)性，染色質(zhì)固縮、碎裂呈團(tuán)塊狀，部分細(xì)胞器溶解消失，可見胞漿中有黑色Fe顆粒沉積。
　　結(jié)論:PFH/Fe3O4@PLGA納米材料內(nèi)包裹的Fe3O4在近紅外光輻照下能夠吸收近紅外光，將光能轉(zhuǎn)換為熱能，從而激發(fā)其內(nèi)的液態(tài)PFH產(chǎn)生相變。近紅外光的光熱效應(yīng)和相變產(chǎn)生的空化及熱膨脹效應(yīng)能夠有效增強近紅外光對體外腫瘤細(xì)胞及體內(nèi)裸鼠腫瘤組織的熱消融作用，破壞腫瘤細(xì)胞及組織，增加細(xì)胞凋亡率