包裹印度墨水的多功能相變型造影劑雙模態(tài)顯像及光聲治療實驗研究.pdf

1、第一部分包裹印度墨水的多功能相變型納米造影劑的制備及性能檢測
　　目的選用高分子材料聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）為外殼，印度墨水（主要成分為炭黑顆粒）及液態(tài)氟碳PFH為內(nèi)核，制備一種光致相變型多功能納米乳液造影劑（ India ink incorporated optically-triggerable phase-transition multifunctional perfluorocarbon nanodroplets,IN

2、Ds），檢測其物理學(xué)、光學(xué)及生物安全性能,并動態(tài)觀察其體外相變的情況。
　　方法:采用三步乳化法制備PLGA包裹的INDs乳液,對其形態(tài)、結(jié)構(gòu)，粒徑、電位，吸收光譜，細(xì)胞毒性，穩(wěn)定性進(jìn)行檢測；以波長532的Q-調(diào) Nd:YAG脈沖激光激發(fā)（5 mJ/cm2，10s），用光學(xué)顯微鏡于高倍視野下觀察制備的乳液液滴中INDs的變化，并于低倍視野下動態(tài)觀察整個INDs乳液液滴在激光激發(fā)后的變化；制備與INDs乳液中包裹相同濃度墨水的單純墨

3、水溶液及空白 PLGA微球，利用光聲成像儀，以波長為800 nm的OPO脈沖激光激發(fā)（8 mJ/cm2，100s），檢測INDs乳液液滴、單純墨水溶液及空白PLGA微球中光聲信號的變化。
　　結(jié)果: INDs溶于去離子水后呈灰黑色乳液，光鏡、激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡觀察， INDs呈球形，形態(tài)規(guī)則，粒徑較均一，分布均勻，表面凹凸呈多孔結(jié)構(gòu)。電鏡圖片中可見少量INDs呈半球形（因電鏡樣本制作所致），從擴(kuò)張孔洞中可見炭黑顆粒被包裹在

4、PLGA外殼中。紫外-可見分光光度計檢測到 INDs與印度墨水吸光度非常相似，其吸光度在可見及近紅外區(qū)域有廣譜的光吸收，變化較小。Malvern激光粒徑儀檢測出INDs平均直徑為（472.5±78.01）nm，Zeta電位為（50.5±4.89） mV。MTT法測得INDs對MDA-MB-231細(xì)胞活性無明顯影響。激光激發(fā)后高倍顯微鏡下見視野中出現(xiàn)直徑2μm～5μm左右氣泡；而在低倍顯微鏡下觀察整個液滴的影像，可見激光激發(fā)后形成的氣泡到

5、達(dá)液滴上層時直徑可達(dá)50μm以上，推測是由小氣泡融合變大形成,其氣化后融合形成的微泡直徑可達(dá)INDs直徑的100倍。光聲成像儀檢測到隨著激光激發(fā)開始，INDs乳液光聲信號瞬時升高，30s后下降到一個較低的穩(wěn)定水平，而單純墨水溶液的光聲信號在激光激發(fā)的時間之內(nèi)一直處于較低的穩(wěn)定水平，其光聲信號強(qiáng)度與INDs低水平期的信號強(qiáng)度基本相同。包裹有墨水的INDs瞬時升高的光聲信號強(qiáng)度比相同濃度單純墨水的信號強(qiáng)度高10倍以上，而空白PLGA微球未測

6、到光聲信號。
　　結(jié)論:成功制備出 INDs乳液造影劑，該造影劑形態(tài)規(guī)則、大小均勻，穩(wěn)定性高，生物安全性好，具有廣譜吸光性。因其強(qiáng)大的光吸收性能，較低能量的激光就能促進(jìn)其液氣相變。因此，此光致相變型造影劑具有增強(qiáng)光聲顯像及超聲顯像的潛力。
　　第二部分包裹印度墨水的多功能相變型納米造影劑增強(qiáng)光聲及超聲顯像實驗
　　目的:測試制備的INDs乳液體外及體內(nèi)光聲成像的效果；對比觀察INDs乳液體外及體內(nèi)超聲顯像的效果。探討其

7、增強(qiáng)光聲及超聲成像原理，驗證其實現(xiàn)雙模態(tài)顯像的能力。
　　方法:構(gòu)建體外成像模型，利用光聲成像儀，以波長為800 nm的OPO脈沖激光激發(fā)（0.5 mJ/ cm2，30 s），獲取不同濃度的INDs乳液液滴的最大范圍投射梯度圖像，并對其光聲信號強(qiáng)度行定量分析；以波長532的Q-調(diào) Nd:YAG脈沖激光激發(fā)INDs乳液，相同濃度的單純墨水及未包裹墨水的相同濃度的空白微球，應(yīng)用超聲診斷儀采集激光激發(fā)前后的超聲圖像，DFY軟件對其超聲信

8、號強(qiáng)度行定量分析；建立裸鼠MDA-MB-231人乳腺癌移植瘤模型5只，于腫瘤種植后7-10天，行原位瘤內(nèi)注射注入INDs乳液，按摩1分鐘后，利用光聲成像儀，以波長為800 nm的OPO脈沖激光激發(fā)（0.5 mJ/cm2，65 s），獲取注射前后腫瘤區(qū)域的Bscan光聲圖像，并對其光聲信號強(qiáng)度行定量分析，用紅外線溫度計測試激光輻照前及輻照過程中腫瘤表面的溫度變化；建立裸鼠MDA-MB-231人乳腺癌移植瘤模型15只，于腫瘤種植后7-10天

9、，隨機(jī)分為3組，分別行原位瘤內(nèi)注射注入INDs乳液，相同濃度的單純墨水及未包裹墨水的相同濃度的空白微球，按摩1分鐘后，以波長532的Q-調(diào)Nd:YAG脈沖激光激發(fā)（12 mJ/cm2，10s），應(yīng)用超聲診斷儀采集激光激發(fā)前后腫瘤區(qū)域的超聲圖像，DFY軟件對其超聲信號強(qiáng)度行定量分析，用紅外線溫度計測試激光輻照前及輻照過程中腫瘤表面的溫度變化。激光輻照后6小時及72小時，取下腫瘤觀察其表面及剖面有無凝固性壞死、采集標(biāo)本行HE染色、凋亡檢測及

10、透射電鏡觀察。
　　結(jié)果:體外光聲實驗顯示，在極低能量密度的激光輻照下（0.5 mJ/cm2），INDs不會發(fā)生相變，其光聲信號來自于其內(nèi)包裹的墨水炭黑顆粒穩(wěn)態(tài)的熱彈性膨脹，INDs乳液的光聲信號強(qiáng)度隨其濃度的增加呈線性上升。體外超聲實驗顯示，激光激發(fā)后INDs乳液組回聲明顯增強(qiáng)，其超聲信號強(qiáng)度較激光激發(fā)前明顯增高(P<0.05)，而墨水組及空白微球組超聲信號未見明顯增強(qiáng)。體內(nèi)光聲實驗顯示，雖然由于光聲成像儀能量限制（<1 mJ/

11、cm2），我們獲得的光聲信號主要來自于INDs內(nèi)包裹的墨水炭黑顆粒穩(wěn)態(tài)的熱彈性膨脹，而不是來自于INDs相變時產(chǎn)生的瞬時升高的光聲信號。但是瘤內(nèi)注射INDs乳液后采集到的腫瘤區(qū)域光聲信號強(qiáng)度仍然較注射前明顯增加（P<0.05），其增加幅度可達(dá)20倍以上，腫瘤表面溫度上升不超過2°C。體內(nèi)超聲實驗顯示，激光激發(fā)后注射INDs乳液組腫瘤區(qū)域回聲明顯增強(qiáng)，其超聲信號強(qiáng)度較激光激發(fā)前明顯增高(P<0.05)，而注射墨水組及空白微球組超聲信號未見

12、明顯增強(qiáng)，腫瘤表面溫度上升不超過2°C。腫瘤組織表面及剖面均未見明顯凝固性壞死，HE染色顯示腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見明顯破壞。免疫組化檢測可見少量凋亡腫瘤細(xì)胞。電鏡觀察可見腫瘤細(xì)胞膜及核膜完整，部分線粒體擴(kuò)張，可見正在吞噬墨水炭黑顆粒的細(xì)胞。
　　結(jié)論: INDs作為一種光致相變型液態(tài)氟碳納米造影劑，具有體內(nèi)及體外增強(qiáng)光聲、超聲雙模態(tài)顯像的能力，其在增強(qiáng)組織光聲及超聲顯像過程中，未造成嚴(yán)重的熱損傷，具備成為診斷性光聲及超聲雙模態(tài)造影

13、劑的潛力。
　　第三部分包裹印度墨水的多功能相變型納米造影劑光聲治療實驗
　　目的:觀察INDs聯(lián)合脈沖激光對腫瘤組織的破壞效果，探討其實現(xiàn)治療目的的原理及機(jī)制；對比觀察INDs用于體內(nèi)成像及治療對腫瘤組織的影響，研究其作為兼具診斷及治療特性的多功能造影劑的潛力及可行性。
　　方法:建立裸鼠MDA-MB-231人乳腺癌移植瘤模型10只，于腫瘤種植后7-10天，隨機(jī)分為2組： INDs組(Ⅰ)及INDs空白組（Ⅱ），Ⅰ組

14、行原位瘤內(nèi)注射注入INDs乳液50μL，Ⅱ組行原位瘤內(nèi)注射注入生理鹽水50μL作為對照。經(jīng)局部按摩1 min后，兩組以波長532的Q-調(diào) Nd:YAG脈沖激光輻照（18 mJ/cm2，3min），光斑覆蓋整個腫瘤區(qū)域,用紅外線溫度計測試激光輻照前及輻照過程中腫瘤表面的溫度變化。激光輻照結(jié)束后6小時及72小時，取下腫瘤觀察其表面及剖面有無凝固性壞死、采集標(biāo)本行HE染色、凋亡檢測及透射電鏡觀察。
　　結(jié)果: INDs空白組的觀察結(jié)果與

15、前述光聲及超聲成像組相似。而INDs組腫瘤剖面觀察可見凝固性壞死區(qū)域，HE染色顯示部分腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞膜及核膜碎裂溶解。免疫組化檢測可見大量凋亡腫瘤細(xì)胞，其凋亡指數(shù)明顯高于 INDs空白組、光聲及超聲成像組（P<0.05）。電鏡觀察見部分腫瘤細(xì)胞膜不完整，細(xì)胞器消失，可見胞漿中存在墨水炭黑顆粒的細(xì)胞,腫瘤表面溫度上升不超過2°C。
　　結(jié)論: INDs既能實現(xiàn)增強(qiáng)診斷性光聲及超聲雙模態(tài)成像的目的，也具有治療腫瘤的潛力，是一種