相變型多功能超聲對(duì)比劑顯像及增效HIFU治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分相變型多功能超聲對(duì)比劑PLGA@Fe3O4-PFH的制備及性質(zhì)觀察
　　目的：制備一種裝載超順磁性氧化鐵納米粒、包裹液態(tài)氟碳?xì)ず私Y(jié)構(gòu)的聚乳酸-羥基乙酸（ PLGA）高分子相變型多功能超聲對(duì)比劑（PLGA@Fe3O4-PFH）微球，并檢測(cè)其表征、生物安全性，觀察體外相變的特性。
　　方法：PLGA@Fe3O4-PFH納米微球采用雙乳化法來制備。使用光鏡、電鏡及 Malvern激光粒徑儀來檢測(cè)其表面形貌、分布、結(jié)構(gòu)、粒徑

2、、電位，應(yīng)用CCK8試劑盒來檢測(cè)微球?qū)Ω伟?721細(xì)胞生物活性影響。在光鏡和超聲成像設(shè)備下觀察利用溫度觸發(fā)納米微球1相變前后形態(tài)學(xué)改變，并觀察發(fā)生液氣相變的條件及參數(shù)。
　　結(jié)果： PLGA@Fe3O4-PFH微球乳液呈淺棕褐色。光鏡及掃描電鏡下觀察到其呈球形，形態(tài)規(guī)則，大小較均勻，分散度較好。馬爾文激光粒徑儀檢測(cè)其粒徑為561.9±207.2nm，電位為0.0238±5.39mv。透射電鏡下可以觀察到 Fe3O4納米顆粒均勻地分

3、布在微球的殼囊中。CCK8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示PLGA@Fe3O4-PFH微球?qū)?721肝癌細(xì)胞生物活性無明顯影響。體外熱致相變實(shí)驗(yàn)觀察到：微球在64℃開始出現(xiàn)微氣泡產(chǎn)生，80℃微泡產(chǎn)生最明顯，90℃時(shí)微泡大部分破裂，僅見少量的微泡。
　　結(jié)論：我們成功地制備了以液態(tài)氟碳為核心，殼膜裝載超順磁性氧化鐵納米粒的高分子可相變PLGA@Fe3O4-PFH微球。其具有粒徑小、分散性好、形態(tài)穩(wěn)定、無細(xì)胞毒性等特點(diǎn)，在體外能發(fā)生熱致相變，具有成為

4、新型的相變型多功能超聲對(duì)比劑的潛力。
　　第二部分 PLGA@Fe3O4-PFH增強(qiáng)超聲、磁共振和光聲顯像的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：觀察相變型多功能超聲對(duì)比劑PLGA@Fe3O4-PFH增強(qiáng)體外超聲、磁共振、光聲成像和體內(nèi)磁共振成像的效果，探討其作為多模態(tài)對(duì)比劑的可行性。
　　方法：體外顯像實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用溫度及超聲激發(fā)PLGA@Fe3O4-PFH微球，超聲成像設(shè)備觀察其相變前后在基波及諧波模式下圖像灰度改變。制備體外成像凝膠模

5、型，使用磁共振成像系統(tǒng)對(duì)梯度濃度的PLGA@Fe3O4-PFH的微球樣品進(jìn)行掃描，觀察磁共振信號(hào)強(qiáng)度改變。體外光聲檢測(cè)在小動(dòng)物光聲成像系統(tǒng)上進(jìn)行，激光以680nm-950nm的波長(zhǎng)范圍輻照相同濃度的PLGA、PLGA@Fe3O4和PLGA@Fe3O4-PFH三組樣品，觀察光聲圖像信號(hào)強(qiáng)度變化。建立16只兔 VX2肝癌移植模型，隨機(jī)分為4組。于腫瘤移植成功后21 d，分別經(jīng)兔耳緣靜脈注入1ml/kg的生理鹽水、PLGA、PLGA@Fe3O

6、4和PLGA@Fe3O4-PFH，在注射前后行MR T2WI平掃及增強(qiáng)掃描，在MR圖像上測(cè)量正常肝實(shí)質(zhì)和腫瘤組織的信號(hào)改變。
　　結(jié)果：在體外，PLGA@Fe3O4-PFH微球在超聲B模式下圖像上呈高回聲，造影模式下未見增強(qiáng)的超聲信號(hào)；相變后，B模式下及造影模式下超聲回聲強(qiáng)度明顯增高。其在磁共振T2 WI圖像上呈負(fù)性增強(qiáng)顯像，即隨著Fe3O4納米粒含量的逐漸增高，MR信號(hào)強(qiáng)度明顯降低；在695 nm波長(zhǎng)處，PLGA@Fe3O4-P

7、FH能夠產(chǎn)生最強(qiáng)的光聲信號(hào)峰值。以695nm波長(zhǎng)的激光輻照樣品，其信號(hào)強(qiáng)度隨著時(shí)間延長(zhǎng)未見明顯衰減。體內(nèi)肝癌MR造影顯示，注射PLGA@Fe3O4-PFH后1min肝實(shí)質(zhì)信號(hào)明顯減低，而肝癌信號(hào)僅輕度減低。PLGA@Fe3O4-PFH組和PLGA@Fe3O4組肝實(shí)質(zhì)與肝腫瘤信號(hào)差異明顯高于PLGA組和生理鹽水組。
　　結(jié)論： PLGA@Fe3O4-PFH具有體外增強(qiáng)超聲、光聲和磁共振三模態(tài)顯像的能力，有成為多模態(tài)對(duì)比劑的潛能。在體

8、內(nèi)實(shí)驗(yàn)中， PLGA@Fe3O4-PFH能明顯增加兔 VX2肝臟腫瘤與正常肝實(shí)質(zhì)間信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比值，對(duì)今后應(yīng)用于臨床MR診斷具有一定的參考價(jià)值。
　　第三部分 PLGA@Fe3O4-PFH增效HIFU治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：通過觀察PLGA@Fe3O4-PFH在體外增效HIFU消融離體牛肝及體內(nèi)經(jīng)動(dòng)脈導(dǎo)管注入對(duì)比劑聯(lián)合碘化油栓塞來增效 HIFU治療兔VX2肝移植瘤的消融效果，來探討其作為 HIFU增效劑及聯(lián)合動(dòng)脈栓塞技術(shù)

9、在HIFU治療肝癌中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：體外實(shí)驗(yàn)部分：以新鮮脫氣離體牛肝為治療模型，局部注射 PLGA@Fe3O4-PFH微球溶液200μl后，給予不同輸出聲功率（120 W，150 W，180 W）、不同時(shí)間（3 s，5 s，8 s）的HIFU輻照，通過牛肝消融區(qū)灰度變化值和凝固性壞死的體積來評(píng)價(jià)PLGA@Fe3O4-PFH增強(qiáng) HIFU消融效果，另以 PBS液、PLGA、PLGA@Fe3O4、PLGA@PFH為對(duì)照組。

10、r>　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分：建立20只兔肝 VX2移植瘤模型，于腫瘤接種成功后21天，隨機(jī)分為4組：生理鹽水組、碘化油組、PLGA@Fe3O4-PFH組、PLGA@Fe3O4-PFH聯(lián)合碘化油栓塞組。各組動(dòng)物均經(jīng)肝動(dòng)脈插管注入生理鹽水、碘化油、PLGA@Fe3O4-PFH、PLGA@Fe3O4-PFH+碘化油各0.5 mL后行HIFU定點(diǎn)消融，消融聲功率180 W，輻照時(shí)間3 s。HIFU消融三天后，觀測(cè)消融區(qū)灰度變化及凝固性壞死體積，收集標(biāo)

11、本行HE染色、普魯士藍(lán)染色、油紅O染色、免疫組化（PCNA、TUNEL）檢測(cè)及組織透射電鏡觀察。
　　結(jié)果：體外離體牛肝 HIFU消融后焦點(diǎn)區(qū)灰度變化值和凝固性壞死體積較注射 PBS、PLGA、PLGA@Fe3O4、PLGA@PFH組明顯增大（ P<0.05）。在體內(nèi) HIFU消融兔 VX2肝癌癌實(shí)驗(yàn)中， PLGA@Fe3O4-PFH聯(lián)合碘化油栓塞組，消融區(qū)灰度變化值及肝癌凝固性壞死體積較生理鹽水組、單純動(dòng)脈栓塞組、單純PLGA@

12、Fe3O4-PFH組明顯增加（P<0.05），免疫組織組化結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織增殖指數(shù)（PI）較其他三組明顯降低、凋亡指數(shù)(AI)較其他三組明顯增高（P<0.05）。HE組織切片顯示焦點(diǎn)區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，凝固性壞死區(qū)與周圍組織界限清楚。油紅 O染色提示碘化油主要存積在腫瘤微血管內(nèi)，普魯士藍(lán)染色提示PLGA@Fe3O4-PFH能穿過血管間隙進(jìn)入腫瘤組織內(nèi)，組織電鏡下觀察，消融區(qū)腫瘤細(xì)胞膜破壞，核膜中斷，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)顯示不清，核膜下可見Fe