吡格列酮對(duì)非酒精性能脂肪性肝病大鼠脂滴代謝及Perilipin蛋白表達(dá)的預(yù)防作用.pdf

1、目的:非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)的概念于上世紀(jì)八十年代提出，是指無(wú)酒精攝入過(guò)多(＜20g/d)及其他外源性肝臟損傷因子情況下而發(fā)生的以脂肪在肝細(xì)胞中蓄積至彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性為主要病理特征的的一組臨床綜合征。NAFLD的發(fā)病具有遺傳-環(huán)境-代謝模式，其疾病譜包含從單純性脂肪變到非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，

2、再進(jìn)一步發(fā)展至NASH相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌。目前，NAFLD存在于10％-24％的全部人群中，而在肥胖人群中發(fā)病率已上升到75％。在美國(guó)幾乎3.01億的肥胖人群有脂肪變，860萬(wàn)的肥胖人群有脂肪性肝炎。越來(lái)越多的證據(jù)表明NAFLD是肥胖、高胰島素血癥、外周胰島素抵抗、血糖異?；蛱悄虿?、高甘油三酯血癥、高血壓等代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)。近年來(lái)，隨著生活方式的變化，尤其是飲食結(jié)構(gòu)變化和體育鍛煉的減少，NAFLD病人逐年增多，年齡結(jié)構(gòu)日益年輕化

3、，因此NAFLD已經(jīng)成為全球公認(rèn)的健康問(wèn)題。到目前為止，NAFLD發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，深入探索NAFLD發(fā)病機(jī)制從而為其防治提供新的靶點(diǎn)，已經(jīng)成為廣大醫(yī)務(wù)工作者迫切解決的問(wèn)題。
　　肝臟脂肪變涉及到過(guò)多的脂質(zhì)積累，主要是甘油三酯(triglyceride，TG)，它是NAFLD的主要標(biāo)志。脂質(zhì)主要以TG的形式儲(chǔ)存在肝細(xì)胞脂滴中。脂滴是球形的細(xì)胞器以中性脂質(zhì)為中心，表面由磷脂單層和很多特殊的蛋白覆蓋。脂滴以TG的形式短暫儲(chǔ)存脂肪酸

4、，在脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起重要作用。過(guò)多脂滴在非脂肪組織例如肝臟、冠狀動(dòng)脈、胰島中積累，易形成脂肪肝、冠心病、2型糖尿病等代謝性疾病。脂滴表面蛋白在脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)交換、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架方面起重要作用。研究最多的和最豐富的脂滴表面蛋白是PAT家族蛋白，它們具有類(lèi)似的序列并且都定位在脂滴中。以前研究表明PAT家族蛋白在脂肪組織、類(lèi)固醇生成細(xì)胞、乳腺組織、酒精性肝病中表達(dá)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)PAT家族蛋白與NAFLD也有關(guān)系。PAT家族蛋白包括:p

5、erilipin1(perilipin)、perilipin2（ADRP）、 perilipin3(TIP47)、perilipin4(S3-12)、perilipin5(OXPAT)。近年來(lái)人們對(duì)perilipin與肥胖、糖尿病、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤之的關(guān)系研究的越來(lái)越多，但關(guān)于perilipin蛋白表達(dá)與脂滴代謝及NAFLD之間的關(guān)系研究的還比較少。因此本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高脂飲食建立NAFLD模型，給予吡格列酮干預(yù)，研究它們之間的

6、關(guān)系，從而進(jìn)一步闡明NAFLD發(fā)病機(jī)制，為其防治提供潛在的靶點(diǎn)。
　　方法:1、選用雄性SD(Sprague Dawley)大鼠24只，體重180±20 g，普通飼料喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成3組:正常對(duì)照組(NC group，n=8)、高脂飲食組（HF group，n=8）、藥物預(yù)防組(DP group，n=8)。
　　2、正常對(duì)照組給予普通飼料飲食8周，高脂飲食組給予高脂飲食（82.5％普通飼料、2％膽固醇、10％豬油、5％蛋

7、黃粉、0.5％膽酸鈉）和等容量的生理鹽水灌胃8周;藥物預(yù)防組給予高脂飲食同時(shí)吡格列酮(4mg/kg/d)灌胃8周;每周稱(chēng)取大鼠體重并記錄1次，于8周末時(shí)處死所有大鼠。
　　3、將大鼠肝臟完整分離取出，觀察肝臟大體情況，稱(chēng)取肝臟濕重并計(jì)算肝指數(shù);留取大鼠血清樣本，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清生化指標(biāo):血清甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇（high-density l

8、ipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase，AST);使用銅試劑顯色法測(cè)定血清未酯化游離脂肪酸(nonestesterified free fatty acid NEF

9、FA)及肝組織游離脂肪酸;使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin HE)染色在光鏡下觀察肝臟組織病理變化;使用免疫組織化學(xué)（immunohistochemical IHC）染色方法檢測(cè)各組大鼠perilipin在肝組織中的表達(dá);用western-blot方法測(cè)定各組大鼠肝組織perilipin蛋白含量。
　　結(jié)果:
　　1、各組大鼠體重;肝濕重;肝指數(shù)的變化
　　1.1體重
　　1周末各組大鼠體重?zé)o

10、明顯差異。8周末時(shí)，與正常對(duì)照組(411.54±35.16)(g)相比，高脂組（455.62±30.95）和藥物預(yù)防組(448.23±28.01)體重明顯增加(P＜0.05);與高脂組相比，藥物預(yù)防組體重略減輕，但兩者沒(méi)有明顯差異(P=0.64＞0.05)。
　　1.2肝濕重
　　與正常對(duì)照組(11.51±2.08)(g)相比，高脂組(23.65±3.13)和藥物預(yù)防組(20.30±3.16)肝濕重明顯高于正常對(duì)照組(P＜0

11、.05);與高脂組相比，藥物預(yù)防組肝濕重明顯降低(P＜0.05)。
　　1.3肝指數(shù)
　　與正常對(duì)照組(2.76±0.36)(％)相比，高脂組(5.20±0.63)和藥物預(yù)防組(4.47±0.60)肝指數(shù)明顯升高（P＜0.05）;與高脂組相比，藥物預(yù)防組肝指數(shù)降低(P＜0.05)。
　　2、血清生化指標(biāo)的比較
　　2.1血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)
　　與正常對(duì)照組(0.43±0.30)(mmol

12、/L)相比，高脂組血清TG(0.81±0.25)明顯升高(P＜0.05);藥物預(yù)防組(0.45±0.34)明顯低于高脂組(P＜0.05)，較正常對(duì)照組略升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.889＞0.05);與正常對(duì)照組(1.64±0.31)(mmol/L)相比，高脂組血清TC(2.65±0.50)明顯升高;藥物預(yù)防組TC(2.17±0.53)明顯低于高脂組(P＜0.05)，而較正常對(duì)照組升高(P＜0.05)。
　　2.2血清高密度脂蛋

13、白（HDL-C）、低密度脂蛋白(LDL-C)
　　高脂組血清HDL-C(0.71±0.24)(mmol/L)較正常對(duì)照組(0.99±0.27)明顯降低（P＜0.05），藥物預(yù)防組HDL-C(0.66±0.22)較高脂組降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.69＞0.05)。高脂組血清LDL-C(1.66±0.40)(mmol/L)明顯高于正常對(duì)照組(0.97±0.25)(P＜0.05)，藥物預(yù)防組LDL-C(1.09±0.39)較高脂組降

14、低(P＜0.05)，而仍高于正常對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.52＞0.05)。
　　2.3血清游離脂肪酸(FFA)
　　高脂組血清FFA（731.7±49.59）（μmol/L）明顯高于正常對(duì)照組(641.05±50.94)(P＜0.05)，藥物預(yù)防組血清FFA（655.58±48.07）明顯低于高脂組（P＜0.05），略高于正常對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.56＞0.05)。
　　2.4血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(A

15、LT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)
　　高脂組ALT（70.02±19.45）(U/L)較正常組（23.33±7.26）顯著升高(P＜0.05)，而藥物預(yù)防組（44.96±12.40）較高脂組顯著降低(P＜0.05);高脂組AST(182.02±17.91)(U/L)較正常對(duì)照組(99.59±7.10)明顯增高(P＜0.05)，藥物預(yù)防組AST(144.33±22.34)較高脂組明顯下降(P＜0.05)。
　　3、肝組織游

16、離脂肪酸(FFA)的比較
　　與正常對(duì)照組肝組織FFA(84.10±9.21)(μmol/L/gprot)相比，高脂組(223.37±21.28)和藥物預(yù)防組(137.23±28.92)明顯升高(P＜0.05);與高脂組相比，藥物預(yù)防組FFA明顯降低(P＜0.05)。
　　4、肝臟大體情況及病理變化
　　正常對(duì)照組大鼠肝臟光滑、有光澤，呈紅褐色，HE染色未發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);高脂組大鼠肝臟無(wú)光澤，表面不平

17、，觸之有油膩感，呈深黃色，HE染色可見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)有大小不等的脂滴，有些區(qū)域肝小葉內(nèi)及匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的壞死;藥物預(yù)防組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度較高脂組明顯改善。
　　5、各組大鼠肝組織perilipin免疫組化比較
　　表達(dá)perilipin的陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，正常組大鼠肝組織perilipin表達(dá)于肝細(xì)胞膜上，高脂組和藥物預(yù)防組perilipin不僅表達(dá)于肝細(xì)胞膜上，也表達(dá)于較大脂滴上。
　　6、各

18、組大鼠肝組織perilipin蛋白表達(dá)的比較
　　高脂組perilipin蛋白(0.84±0.05)顯著高于正常對(duì)照組(0.55±0.06)(P＜0.05);藥物預(yù)防組(0.61±0.06)明顯低于高脂組(P＜0.05)，與正常對(duì)照組相比略高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.14＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、高脂飲食可以成功建立大鼠非酒精性脂肪性肝病模型。
　　2、高脂飲食組大鼠肝組織perilipin蛋白表達(dá)增多