加減駐景方對Akt基因轉(zhuǎn)染后ARPE-19細(xì)胞表達(dá)VEGF的影響及機制研究.pdf

1、研究目的:
　　1.觀察加減駐景方含藥血清對Akt轉(zhuǎn)染后ARPE-19細(xì)胞增殖的影響。
　　2.探討加減駐景方含藥血清對Akt轉(zhuǎn)染后ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF含量的影響，并觀察其對ARPE-19細(xì)胞Akt、mTOR和HIF-1a因子表達(dá)的影響，初步探討加減駐景方抑制CNV形成的分子通路機制。
　　研究方法:
　　1.體外培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞，取生長良好的細(xì)胞用于實驗，分為正常組、空白血清組、含藥血清

2、組、康柏西普組并設(shè)立不同干預(yù)濃度及觀測時間。
　　2.CCK-8法檢測各組血清及藥物對細(xì)胞活性的影響。
　　3.將重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-AKT以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞，建立Akt基因轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞模型。
　　4.用免疫印跡法(Western Blot)檢測驗證模型細(xì)胞構(gòu)建成功。
　　5.體外培養(yǎng)ARPE-19模型細(xì)胞，取生長狀態(tài)良好用于實驗，分為正常組、模型組、模型細(xì)胞干預(yù)組（空白

3、血清組、含藥血清組、康柏西普組），并設(shè)立不同干預(yù)濃度及觀測時間。
　　6.CCK-8法檢測各組對轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞活性的影響。
　　7.用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測各組轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞上清中VEGF生長因子的表達(dá)。
　　8.用實時定量PCR（RT-PCR）法檢測各組轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞中AKT、mTOR、HIF-1a、VEGF基因(mRNA)的表達(dá)情況。
　　9.用免疫印跡法(Western Blot)檢測各組轉(zhuǎn)染模型細(xì)

4、胞中AKT、mTOR、HIF-1a、VEGF蛋白表達(dá)的情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.不同濃度的空白血清組、含藥血清組培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞24h后，各組細(xì)胞活性與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，對細(xì)胞生長無毒性;各組作用ARPE-19細(xì)胞48h及72h后血清高濃度組(20％、40％)細(xì)胞活性低于正常細(xì)胞組(P＜0.05)，而2.5％、5％、10％血清濃度對細(xì)胞活性影響不大(P＞0.05);康柏西普藥物組各濃度

5、作用細(xì)胞24h、48h、72h后，僅20μg/ml濃度與正常組比型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明含藥血清及康柏曲普對Akt過表達(dá)后細(xì)胞中HIF-1αmRNA的表達(dá)量無明顯影響。
　　6.Western Blot法檢測顯示:正常培養(yǎng)24h和48h的轉(zhuǎn)染模型組細(xì)胞Akt、mTor、VEGF蛋白表達(dá)量顯著高于正常細(xì)胞組(P＜0.05)，說明Akt轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞后，細(xì)胞中Akt、mTor、VEGF蛋白表達(dá)增加;空白

6、血清組與轉(zhuǎn)染模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);含藥血清組、康柏西普組與轉(zhuǎn)染模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);康柏西普組細(xì)胞中各因子含量小于含藥血清組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明含藥血清及康柏西普可抑制Akt過表達(dá)后細(xì)胞中Akt、mTor、VEGF蛋白的表達(dá)量;正常培養(yǎng)24h和48h的轉(zhuǎn)染模型組細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)量和正常細(xì)胞組比較無明顯差異(P＞0.05)，空白血清、含藥血清及康柏西普組與模型組比較沒有

7、顯著性差異(P＞0.05)，說明含藥血清及康柏西普對Akt過表達(dá)后細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)量無明顯影響。
　　研究結(jié)論:
　　1.Akt基因轉(zhuǎn)染后可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞的增殖，增加細(xì)胞中AKT、mTOR、VEGF mRNA及蛋白的表達(dá);
　　2.加減駐景方含藥血清對Akt轉(zhuǎn)染后ARPE-19細(xì)胞的增殖及AKT、mTOR、VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)有抑制作用;
　　3.加減駐景方可能是通過抑制AKT的活化