VEGF基因轉(zhuǎn)染對骨及軟組織損傷影響的實驗研究.pdf

1、目的：構(gòu)建兔血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子165(VEGF<,166>)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-VEGFl65，并檢測其序列及片段大小，為其在治療骨缺損及軟組織損傷的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法：應(yīng)用Trizol總RNA提取試劑盒，按照其要求步驟，從兔骨組織中提取總RNA，根據(jù)GENEBANK設(shè)計兔基因片段VEGFl65引物，上游引物為：5’GTG GAC ATCTTCCAG GAG TA 3’，下游引物為：5’CTT TGG TCI G

2、CA TTC ACA 3’，片段長度為187bp，逆轉(zhuǎn)錄制備eDNA，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物，將此目的基因片斷與pMD18-T載體在連接液混合連接，制備VEGF165真核表達(dá)載體；取連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞溶液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并將細(xì)胞涂布在含氨芐青霉素的平板上，37℃過夜，從平板上挑選單克隆鑒定，將陽性克隆接入LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用質(zhì)粒DNA小量快速試劑盒抽提質(zhì)粒，將產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳及質(zhì)粒測序；分別將質(zhì)粒和pcDNA3.1載體以EcoR I

3、和HindⅢ雙酶切，反應(yīng)體系體積20 μl，37℃2h，以凝膠分別回收目的基因片斷，取二者的回收產(chǎn)物與2u T4-DNA連接酶和buffer液混合連接，反應(yīng)體系總體積10 μl，37℃過夜，所得產(chǎn)物以2％瓊脂糖凝膠電泳分析，并行質(zhì)粒DNA直接測序。 結(jié)果：所得產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳分析于5.4kb處出現(xiàn)特異性條帶：雙酶切產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)分別于約5.4kb、187bp處出現(xiàn)特異性條帶，測序表明pcDNA3.1-V