人巨細胞病毒及其IE86蛋白對ARPE-19細胞周期影響的研究.pdf

1、目的：研究人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染人視網(wǎng)膜色素上皮細胞ARPE-19后對其細胞周期的影響，研究這種影響與HCMV IE86基因的相關(guān)性，探討HCMV感染導致巨細胞病毒性視網(wǎng)膜炎的發(fā)病機制。
　　 方法：用HCMV感染同步化于G0/G1期的ARPE-19細胞作為感染組，同時設(shè)未感染組為對照組。于感染后ld、2d、3d、4d和5d收獲細胞，RT-PCR方法檢測HCMV IE72、IE8

2、6 mRNA水平的表達，用免疫熒光法檢測細胞核內(nèi)HCMV IE蛋白的表達，Westernblot法檢測HCMV早期蛋白IE72、IE86和晚期蛋白pp65的表達。MTT法檢測病毒感染1～6天后對細胞增殖的影響，流式細胞術(shù)檢測感染組與未感染組細胞DNA含量的變化。Western blot法檢測病毒感染后細胞Cyclin D1、Cyclin E表達的變化。采用PCR方法從質(zhì)粒plEP86AD169擴增出IE86基因片段，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pE

3、GFP-N3-IE86，脂質(zhì)體介導瞬時轉(zhuǎn)染ARPE-19細胞，RT-PCR、免疫熒光法分析IE86基因的表達。流式細胞術(shù)檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組細胞DNA含量的變化。
　　 結(jié)果：HCMV IE72的mRNA在病毒感染后第1天檢測到開始表達，IE86的mRNA在感染后第3天檢測到開始表達；HCMV IE72、IE86和pp65蛋白可分別在病毒感染ARPE-19細胞2天、3天和5天時開始表達。MTT檢測顯示病毒感染3-6天后OD值

4、分別為(0.646±0.0558)、(0.6644±0.0765)、(0.723±0.1474)和(0.803±0.1073)，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。流式細胞術(shù)示感染組在感染后第3天、4天、5天細胞周期的S期細胞比率為（21.78％±2.65％），（26.65％±0.71％），(31.80％±3.97％)，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P

5、達，自感染3天起表達量開始下降。Cyclin E在未感染細胞及病毒感染1天時呈低表達狀態(tài)，自感染第2天起表達量開始上升。
　　 瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N3-IE86后24小時可檢測到IE86在mRNA水平和蛋白水平的表達。質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染48小時后細胞周期中S期細胞比率為(20.74％±1.60％)，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05）。
　　 結(jié)論：HCMV可感染ARPE-19細胞。HCMV可促同步化于G0/G