人巨細(xì)胞病毒感染對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞周期及復(fù)制前復(fù)合物的影響.pdf

1、目的:研究人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)后對(duì)其細(xì)胞周期及復(fù)制前復(fù)合物(pre-RC)的影響。探討HCMV感染的發(fā)病機(jī)制。 方法: 1、血清饑餓法同步化HELF于G0/G1期，用HCMV感染同步化的HELF作為感染組(細(xì)胞數(shù)=1×106)，同時(shí)設(shè)模擬感染組為對(duì)照組(細(xì)胞數(shù)=1×106)。用倒置相差顯微鏡觀察兩組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化至感染后7天，于感染后12、24、48、72和96小時(shí)收獲細(xì)胞。

2、2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)HELF細(xì)胞周期。 3、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)兩組HELF細(xì)胞核內(nèi)HCMVIE172蛋白，Cdt1蛋白水平。 4、提取總RNA，用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)兩組HELF復(fù)制前復(fù)合物Cdt1 mRNA、Cdc6 mRNA、Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA的表達(dá)水平。 5、RT-PCR法檢測(cè)兩組HELF復(fù)制抑制因子Geminin的表達(dá)水平。 結(jié)果: 1、兩組HE

3、LF細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：感染組HELF感染后72h時(shí)即可見(jiàn)局部細(xì)胞變圓，膨脹，細(xì)胞體及細(xì)胞核巨大化，7天時(shí)可見(jiàn)所有細(xì)胞均發(fā)生病變；模擬感染組HELF各時(shí)間點(diǎn)均未見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 2、兩組HELF HCMVIE172蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)：感染組HELF于感染后12h時(shí)細(xì)胞核內(nèi)即出現(xiàn)呈棕黃色顆粒的HCMVIE172蛋白產(chǎn)物的表達(dá)；模擬感染組HELF各時(shí)間點(diǎn)均未出現(xiàn)HCMVIE172蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物。 3、兩組HELF細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果：

4、感染組在感染后12h時(shí)有70.4％的細(xì)胞處于G1期，24h時(shí)有69.9％的細(xì)胞處于G1期；模擬感染組在感染后12h時(shí)有65.7％的細(xì)胞處于G1期，24h時(shí)有43.8％的細(xì)胞處于G1期。感染組HELF停滯G1期于較模擬感染組明顯增多，兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、兩組HELF Cdt1 mRNA表達(dá)水平：模擬感染組在感染后12h時(shí)Cdt1 mRNA表達(dá)水平最高，后逐漸下降，至72h時(shí)達(dá)最低水平，96h時(shí)又稍有回升。感染組在感

5、染后12h時(shí)Cdt1 mRNA表達(dá)水平較低，24h時(shí)稍有升高，48h達(dá)最高峰，72h時(shí)開始下降，96h時(shí)大致維持72h水平。兩組比較，12h、24h和48h時(shí)Cdt1 mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，12h和24h時(shí)感染組較模擬感染組明顯降低，48h時(shí)感染組較模擬感染組明顯升高。模擬感染組Cdt1 mRNA表達(dá)水平的高峰出現(xiàn)在感染后12h，而感染組的高峰則出現(xiàn)在感染后48h，較模擬感染組明顯滯后。 5、兩組HELF Cdt1

6、蛋白水平：12h、24h、和96h時(shí)兩組HELF Cdt1蛋白水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，48h、72h時(shí)兩組HELF Cdt1蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。12h和96h時(shí)感染組較模擬感染組明顯降低，24h時(shí)感染組較模擬感染組明顯升高。模擬感染組在感染后12h時(shí)Cdt1蛋白表達(dá)水平最高，后逐漸下降，至24h時(shí)達(dá)最低水平，96h時(shí)又稍有回升；感染組在感染后12h時(shí)Cdt1蛋白表達(dá)水平較低，24h時(shí)達(dá)到最高峰，48h時(shí)急劇下降，一直維持較低的穩(wěn)定

7、水平。 6、兩組HELF Cdc6 mRNA表達(dá)水平：12h、24h、48h、72h和96h時(shí)兩組HELF Cdc6 mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，12h、24h和48h時(shí)感染組較模擬感染組明顯增加，72h和96h時(shí)模擬感染組較感染組明顯升高。感染組在感染后12h時(shí)Cdc6 mRNA表達(dá)水平最高，后逐漸下降，至72h時(shí)達(dá)最低水平，96h時(shí)又稍有回升；模擬感染組在感染12h時(shí)Cdc6 mRNA表達(dá)水平最高，后逐漸下降，至48

8、h時(shí)達(dá)最低水平，72h后開始回升，96h時(shí)繼續(xù)回升。 7、兩組HELF Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA表達(dá)水平：12h、24h、48h、72h、96h時(shí)兩組HELF Mcm2 mRNA、Mcm8mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，12h和24h時(shí)感染組表達(dá)水平低于模擬感染組，48h、72h、96h時(shí)感染組表達(dá)水平明顯高于模擬感染組。模擬感染組Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA表達(dá)水平的高峰出現(xiàn)在感染后24h，而感染組

9、表達(dá)水平的高峰則出現(xiàn)在感染后48h，較模擬感染組有明顯滯后。 8、兩組HELF Geminin mRNA表達(dá)水平：12h、24h、48h和72h時(shí)兩組HELF Geminin mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，12h和24h時(shí)感染組較模擬感染組明顯增加，48h和72h時(shí)感染組較模擬感染組明顯降低。感染組在感染后12h時(shí)Geminin mRNA表達(dá)水平最高，模擬感染組在感染后48h達(dá)最高峰。 結(jié)論: 1、人巨細(xì)胞

10、病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞后在其細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、增殖。 2、人巨細(xì)胞病毒感染阻滯了人胚肺成纖維細(xì)胞周期，使大部分細(xì)胞停滯在G1期。 3、人巨細(xì)胞病毒IE172蛋白的表達(dá)提示人巨細(xì)胞病毒的早期感染。 4、人巨細(xì)胞病毒感染使人胚肺成纖維細(xì)胞復(fù)制前復(fù)合物主要成份Cdt1 mRNA、Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA的表達(dá)水平遲滯、Cdt1蛋白表達(dá)延遲。Cdc6 mRNA高水平表達(dá)。 5、人巨細(xì)胞病毒感染能誘