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文檔簡(jiǎn)介
1、第一部分:缺氧人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株ARPE-19表達(dá)特性
目的:觀察缺氧對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮株ARPE-19的細(xì)胞形態(tài)、增殖以及對(duì)其分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和色素上皮衍生因子表達(dá)的影響。
方法:將ARPE-19細(xì)胞分別置正常和缺氧環(huán)境中培養(yǎng)0hr、8hr、24hr、48hr后,MTT比色法檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞的增殖;Hochest染色觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;選取缺氧24hr的細(xì)
2、胞,RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA及PEDF mRNA的表達(dá),經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理,定量分析。
結(jié)果:缺氧組的MTT實(shí)驗(yàn)吸光度(A值)明顯低于正常組,缺氧48小時(shí)時(shí)差異最顯著(P<0.001);Hochest染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,缺氧24小時(shí)時(shí)其凋亡率明顯高于正常組(P<0.001);RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)缺氧組明顯高于正常組,PEDF mRNA表達(dá)缺氧組明顯低于正常組。
結(jié)論:缺氧
3、可加劇ARPE-19細(xì)胞的凋亡,破壞VEGF與PEDF表達(dá)的平衡,調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的活性是抑制脈絡(luò)膜新生血管生成的關(guān)鍵。
第二部分:缺氧人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株ARPE-19 MicroRNA的差異表達(dá)
目的: MicroRNA在調(diào)控基因表達(dá)及組織功能等方面發(fā)揮著重要的作用。但對(duì)其在眼科領(lǐng)域?qū)τ贑NV的形成的調(diào)控卻研究的很少。本部分目的在于篩選CNV形成相關(guān)的MicroRNA。
方法:視網(wǎng)膜
4、色素上皮細(xì)胞株ARPE-19置缺氧環(huán)境24小時(shí)后,抽提RNA進(jìn)行MicroRNA芯片(LC science公司)檢測(cè)。對(duì)于信號(hào)值高于1000的差異MicroRNA利用實(shí)時(shí)定量PCR(q-PCR)進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果:具有顯著性差異(即p值<0.01)表達(dá)轉(zhuǎn)錄子共有42條miRNA,其中低氧后上調(diào)的18條,下調(diào)的24條,信號(hào)值差異位居前十位的MicroRNA分別為Mir-1、Mir-1469、Mir-663、Mir-1915、M
5、ir-29c、Mir-574-5p、Mir-638、Mir-29b-1、Mir-1308、Mir-10a,其中除Mir-1、Mir-29c、Mir-1308表現(xiàn)為下調(diào)外,其余均表現(xiàn)為上調(diào)。信號(hào)值高于1000的MicroRNA共有28條,其中Mir-638、Mir-1308、Mir-125b、Mir-155、Mir-30c、Mir-125a-5p與芯片檢測(cè)結(jié)果相一致,Mir-155表達(dá)異常最為顯著。
結(jié)論:視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞
6、株ARPE-19細(xì)胞經(jīng)缺氧處理后,很多MicroRNA發(fā)生差異性表達(dá),可能與CNV的形成密切相關(guān)。
第三部分: MicroRNA-155轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株ARPE-19活性初步研究
目的:探討對(duì)于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株ARPE-19細(xì)胞,Mir-155是否具有一定的抗缺氧活性,并對(duì)CNV的形成具有一定的調(diào)節(jié)作用。
方法:Mir-155轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株ARPE-19細(xì)胞后,將其置缺氧
7、環(huán)境0hr,8hr、24hr、48hr后,MTT比色法檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞的增殖,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
結(jié)果:轉(zhuǎn)染組的MTT實(shí)驗(yàn)吸光度(A值)高于未轉(zhuǎn)染組,缺氧48小時(shí)時(shí)差異最明顯;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,轉(zhuǎn)染組凋亡率低于未轉(zhuǎn)染組(P<0.001),缺氧48小時(shí)時(shí)差異最明顯。
結(jié)論:Mir-155轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株ARPE-19細(xì)胞后,具有一定的抗缺氧活性,對(duì)CNV的形成具有一定的調(diào)節(jié)作用。<
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