穿心蓮內酯改善MPTP帕金森小鼠運動功能及體外對抗魚藤酮損傷的線粒體機制.pdf

1、目的：
　　研究穿心蓮內酯對抗MPTP誘導的小鼠帕金森病運動障礙和魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞的損傷作用，探討穿心蓮內酯對帕金森病患者的線粒體功能的影響，揭示其保護神經(jīng)元、防治帕金森病的可能機制，為穿心蓮內酯的臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　連續(xù)5天腹腔注射25 mg/kg MPTP誘導小鼠帕金森病，造模同時腹腔注射2.5 mg/kg和5 mg/kg穿心蓮內酯給藥，連續(xù)12天，采用開場實驗，爬桿實驗，轉輪實驗

2、，強迫游泳，懸掛實驗檢測小鼠運動功能。采用Western Blot和免疫組化分析黑質區(qū)酪氨酸羥化酶的表達；Nissl染色來檢測小鼠中腦蛋白合成功能；MDA，SOD和Catalase試劑盒檢測小鼠黑質部氧化應激水平；TUNEL染色檢測小鼠黑質部神經(jīng)元凋亡情況;采用ELISA檢測各組小鼠外周血炎癥因子水平，Real time-PCR檢測小鼠中腦區(qū)炎癥因子mRNA表達水平；免疫熒光染色檢測小膠質細胞活化標志Iba-1；通過電鏡觀察分析小鼠黑質

3、區(qū)線粒體數(shù)目和形態(tài)以及Real time-PCR檢測小鼠黑質線粒體拷貝數(shù)和線粒體復制能力。離體實驗中以不同濃度的穿心蓮內酯處理SH-SY5Y細胞3 h，加入30μmol/L Rotenone作用6h，MTT法檢測細胞的活性；Annexin-V/PI雙染檢測細胞凋亡率。DCFH-DA染色檢測細胞內活性氧（ROS）生成，JC-1染色檢測細胞線粒體膜電位的變化，熒光素酶法檢測ATP含量，Clark氧電極檢測細胞線粒體呼吸功能。MDA和SOD試

4、劑盒檢測細胞MDA，SOD含量分析細胞氧化應激。MitoTracker green染色流式細胞分析儀檢測線粒體數(shù)目變化，Real time-PCR分析線粒體拷貝數(shù)變化，電鏡觀察分析細胞中線粒體數(shù)目和形態(tài)。
　　結果：
　　在小鼠帕金森病模型中，我們發(fā)現(xiàn)穿心蓮內酯能夠改善PD樣小鼠的運動功能，表現(xiàn)為，穿心蓮內酯給藥能夠提高PD樣小鼠在開場實驗中的運動距離和在中心區(qū)域活動時間，縮短爬桿時間，延長轉輪平衡時間，提高強迫游泳中PD樣

5、小鼠運動協(xié)調能力以及懸掛實驗中的抓握能力，同時能夠改善黑質部分TH的表達和中腦蛋白合成功能。穿心蓮內酯給藥能夠抑制PD樣小鼠黑質部分的氧化應激水平，表現(xiàn)為MDA含量的降低，SOD和Catalase水平的提高，減少大腦黑質中神經(jīng)元的凋亡，抑制炎癥反應，維持黑質部分神經(jīng)元線粒體的形態(tài)和功能。體外實驗表明穿心蓮內酯能夠有效的保護魚藤酮介導的SH-SY5Y細胞損傷。通過MTT檢測，倒置相差顯微鏡觀察以及流式細胞儀檢測凋亡，穿心蓮內酯劑量依賴性的

6、保護SH-SY5Y細胞。穿心蓮內酯能夠抑制魚藤酮誘導的ROS，恢復線粒體膜電位，增加細胞ATP，促進細胞呼吸功能的改善，從而緩解魚藤酮引起的細胞氧化應激。穿心蓮內酯能夠抑制魚藤酮引起的線粒體DNA拷貝數(shù)降低，促進線粒體DNA復制因子mRNA的表達，維持線粒體的正常形態(tài)。
　　結論：
　　以上結果說明，穿心蓮內酯具有顯著改善MPTP致PD樣小鼠云運動功能喪失的作用，抑制氧化應激，抑制炎癥反應，保護線粒體DNA拷貝數(shù)，維持線粒體